Helmholtz-Gemeinschaft

Ergebnisse & Diskussion
Substrate auch einen unterschiedlichen Einfluss auf die BAL besitzen (Kocot, 2010). Dieser
Aspekt sollte im Laufe der vorliegenden Arbeit weiter untersucht werden (Kapitel 4.2.1).
4.1.5 Umstellung des Test- und des Puffersystems zur Ermittlung der Stabilität der
BAL gegenüber aromatischen Aldehyden
Aufgrund der Inkubation des Enzyms mit einem Substrat und der Ermittlung der Restaktivität
mit einem anderen Substrat (3,5-Dimethoxybenzaldehyd), ist das beschriebene Testsystem
nicht optimal für Bestimmung der tatsächlichen Restaktivität. Die Anwesenheit von
verschiedenen Aldehyden kann zur Synthese von gemischten Benzoinen führen, was
wiederum die gemessenen Aktivitäten verfälscht. Des Weiteren können die Mischprodukte
einen unvorhersehbaren Einfluss auf die Fluoreszenz des 3,5-Dimethoxybenzaldehyds haben,
was ebenfalls zu einer Verfälschung der Ergebnisse führen würde. Deshalb wurde ein HPLCbasierter
Test entwickelt, bei dem die BAL mit einer geringen Konzentration eines
aromatischen Aldehyds inkubiert wird und die Restaktivität durch den Einsatz höherer
Konzentrationen desselben Aldehyds ermittelt wird (Abb. 55 und Kapitel 3.10.3).
Des Weiteren ergaben sich Probleme bei der Verwendung des Kaliumphosphat-(Kpi) Puffers.
Neben einer pH-Verschiebung in den alkalischen Bereich durch DMSO Zugabe, wurde bei
Anwesenheit von 10-30 vol% DMSO eine Präzipitation von Magnesiumphosphat beobachtet.
Magnesiumsulfat wird dem Puffer zugesetzt, weil es, neben ThDP, ein wichtiger Kofaktor der
BAL ist. Bei höheren pH-Werten, z.B. pH 7,5-8 konnte teilweise sofort, spätestens nach 2
Tagen eine sichtbare Präzipitation nachgewiesen werden. Aber auch bei niedrigeren pH-
Werten fand in vielen Fällen sofort nach Zugabe der aromatischen Substrate (v. a. den
flüssigen wie 2-Chlor- und 3-Methoxybenzaldehyd) eine Präzipitation von Magnesiumphosphat
statt. Eine Verringerung der MgSO 4 -Konzentration führte nur bedingt zu einer
Verzögerung der Präzipitation. Außerdem zeigten Aktivitätsmessungen mit 3,5-Dimethoxybenzaldehyd,
das der Einsatz des essentiellen Kofaktors unterhalb von 1 mM zwar nicht zu
einer verringerten Stabilität aber zu einer verringerten Aktivität der BAL führt. Bei der
Bildung und Spaltung des unsubstituierten Benzoins wurde in vorangegangenen Arbeiten
zwar kein Unterschied in der Aktivität bei Magnesiumkonzentrationen von 0,025-5 mM
beobachtet (Janzen et al., 2006, Stillger, 2004), jedoch scheint dies nicht für alle BAL
katalysierten Reaktionen zu gelten. Deshalb wurden bei weiteren Versuchen in dieser Arbeit
insgesamt hohe Kofaktorkonzentrationen (0,5 mM ThDP; 2,5mM MgSO 4 ) gewählt, um eine
Limitierung der unterschiedlichen Reaktionen durch die Kofaktoren auszuschließen.
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