Helmholtz-Gemeinschaft

Ergebnisse & Diskussion
Aufgrund der großen Deletion von 13 Aminosäuren und zusätzlich 6 Histidinen am
C-Terminus konnte ein Verlust der strukturellen Integrität des Enzyms nicht ausgeschlossen
werden. Aus diesem Grund wurde alternativ eine zweite Variante geplant bei der der His-Tag
C-terminal erhalten blieb, während die α -Helix und der C-Terminus entfernt wurden
(Abb. 76).
Eine Ligaseaktivität konnte für beide Varianten mit Benzaldehyd und 3,5-Dimethoxybenzaldehyd
als Substraten nachgewiesen werden (Kocot, 2010). Da die ermittelten
Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten beider Deletionsvarianten absolut vergleichbar waren,
wurden nur die kinetischen Parameter der Variante HisBALΔ bestimmt. Die kinetischen
Analysen ergaben eine um das 3-5-Fach verminderte Ligaseaktivität gegenüber der Wildtyp
BAL. Mit (R)-3,3´,5,5´-Tetramethoxybenzoin ist auch die Lyaseaktivität um etwa das 3-4-
Fache verringert. Demgegenüber liegen die Anfangsreaktionsgeschwindigkeiten der
Deletionsvariante für die Benzoinspaltung in einem ähnlichen Bereich wie die der Wildtyp
BAL (Kocot, 2010).
Sofern ermittelbar waren die K M -Werte für die Ligase- sowie Lyaseaktivität für die
Deletionsvariante größer als die K M -Werte des Wildtyps. Die höheren K M -Werte der Variante
im Vergleich zum Wildtypenzym deuten auf eine geringere Affinität der Variante gegenüber
den Benzaldehyd-Derivaten sowie den Benzoinen, was auf eine weniger stabile Bindung im
aktiven Zentrum hinweist. Vermutlich dient der C-Terminus zur Stabilisierung der Bindung
der jeweiligen Substrate im aktiven Zentrum, indem er den relativ großen Reaktionsraum
verschließt und somit die lokale Substratkonzentration erhöht. Möglicherweise unterstützt er
dabei sogar die korrekte Positionierung der Substrate im aktiven Zentrum. Diese Ergebnisse
zeigen, dass die Präsenz des C-terminalen Bereichs in der BAL im Hinblick auf die aktivitätsbestimmenden
Parameter eher förderlich ist und die möglicherweise sterisch gehemmte
Produktfreisetzung durch den verengten Substratkanal, eher einen untergeordneten Einfluss
hat. Bezüglich der Selbstligation zweier Benzaldehyde zeigt die HisBALΔ tatsächlich Charakteristika
der BFDH281A (Kocot, 2010). Eine Überprüfung der Stereoselektivität bei der
Synthese von (R)-Benzoin (Kapitel 3.8.2) ergab keinen Unterschied gegenüber dem Wildtyp
(ee > 99,9%).
Interessanterweise stellte sich heraus, dass die Anwesenheit von DMSO im Puffer für die
katalytische Aktivität der HisBALΔ unbedingt erforderlich ist. Auch bei hohen Enzym-
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