Helmholtz-Gemeinschaft

Material & Methoden
Mit Hilfe der exponentiellen Formel konnte der Umsatz von DMBA durch die BAL über die
Zeit ermittelt werden. Wobei eine Ausgangskonzentration von 3 mM DMBA für die Messung
als sinnvoll erachtet wurde. Die genaue Durchführung, sowie Puffer und Lösungen, werden
im Folgenden beschrieben.
Durchführung am Fluorolog 3-22:
Reaktionspuffer pH 8:
Substratlösung:
50 mM TEA 15 mM DMBA in DMSO
2,5 mM MgSO 4
0,5 mM ThDP
Enzymlösung:
Lyophilisat oder Rohextrakt in Reaktionspuffer
Einstellungen:
Anregung: 350 nm Emission: 460 nm
Anregungsspalt: ± 1,3 nm Emissionsspalt: ± 1,3 nm
Messung: 90 sek Messpunkte: 5 sek
Temperatur: 25 °C Küvettengeometrie: 4x10 mm
Integration: 0,1 sek
Die Substratlösung wurde frisch zubereitet und mit Argon überschichtet, um eine Oxidation
des DMBA weitestgehend zu vermeiden. Vor Beginn der Messung wurden 750 µl Reaktionspuffer
mit 200 µl Substratlösung direkt in die Küvette gegeben, gründlich gemischt und für
ca. 5 min im Photometer auf 25 °C temperiert. Die Reaktion wurde anschließend durch
Zugabe von 50 µl Enzymlösung gestartet. Hierbei sollte nur sehr vorsichtig mit einem
Plastikspatel gerührt werden, da bei der Vermengung viele kleine Luftblasen entstehen
können, welche zu Lichtstreuung führen und so das Resultat verfälschen. Die Enzymlösung
wurde so eingestellt, dass die Abnahme der Fluoreszenzintensität innerhalb der 1,5 min ca.
20.000-40.000 cps entsprach, also einem Umsatz von etwa 0,15-0,33 mM DMBA. Die
Abnahme der Fluoreszenz wurde über einen Zeitraum von 1,5 min verfolgt und anhand der
zuvor erstellten Kalibrierkurve (Gleichung, Abb. 41) der Substratumsatz berechnet. Bei
bekannter Enzymkonzentration konnte so die spezifische Aktivität in Units pro mg Enzym
berechnet werden. Wobei 1 Unit als die Enzymmenge definiert ist, welche 1 µmol Substrat
pro Minute umsetzt.
Anfangsreaktionsgeschwindigkeitsmessungen, werden normalerweise bis zu einem Substratumsatz
von bis zu 10% verfolgt. So sollen Effekte, welche eine Minderung der Reaktionsrate,
wie z.B. Verlangsamung der Reaktion durch Verringerung der Substratkonzentration,
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