universita - Clinica pediatrica - Università degli Studi di Trieste

dal cDNA. Le regioni VH vengono unite stabilmente alle VL mediante una reazione di
ligazione, formando quello che viene definito un single-chain antibody fragment (scFv). Il
scFv viene infine clonato in un vettore fagmidico a monte del gene III codificante per la
proteina g3p del rivestimento del fago M13. Dopo trasformazione di E. coli e infezione
con un fago helper M13, vengono prodotte delle particelle fagiche che esprimono un
anticorpo funzionale sulla loro superficie. Anticorpi specifici verso un determinato
antigene possono essere isolati mediante cicli ripetuti di legame su un antigene
immobilizzato su fase solida, lavaggio, eluizione, infezione di batteri ed amplificazione
dei dei fagi legati all’antigene. Infine, i cloni batterici che esprimono una specificità
anticorpale contro l'antigene sono caratterizzati per l'epitopo riconosciuti
In dettaglio i protocolli che sono stati seguiti per le selezioni e per il fingherprinting sono i
seguenti
SELEZIONI
1° Giorno
1. Inoculare 10-20 μl della mini-libreria raccolta in 10 ml di 2xYT + Ampicillina
(Amp) 1% + glucosio 1% in modo da partire da una DO600 iniziale = 0.05 (= 5x10 7
batteri/ml; con una libreria il cui titolo è pari a 10 5 -10 6 , la rappresentatività della
diversità è garantita).
2. Far crescere in agitazione a 37°C fino a DO600 = 0.5.
3. Infettare con fago helper in modo che il rapporto MOI fago:batteri sia 100:1 e
lasciare fermo per 45' a 37°C.
4. Centrifugare a 3000 rpm per 15' a T ambiente.
5. Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in 50 ml di 2xYT + Amp 1% +
Kanamicina (Kan) 1%.
6. Far crescere in agitazione O/N a 28°- 30°C.
COATING: saturare un immunotubo con l’antigene (htTG) 10 μg/ml diluito in 500 μl - 1
ml di PBS 1X e lasciare O/N a 4°C.
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