universita - Clinica pediatrica - Università degli Studi di Trieste

2° Giorno
1. Centrifugare a 7000-8000 rpm per 20' a 10°C.
2. Aggiungere a 40 ml del sopranatante 10 ml di PEG-NaCl sterile.
3. Lasciar precipitare in ghiaccio per 45', agitando ogni tanto.
4. Centrifugare a 5000 rpm per 20'.
5. Eliminare il sopranatante e risospendere il pellet in 1 ml di PBS 1X; trasferire in
un'Eppendorf da 1,5 ml.
6. Centrifugare a 13000 rpm per 5' e recuperare 900 μl di fagi presenti nel
sopranatante.
7. Saturare i fagi 1:1 in latte 4% per 45'-1h a T ambiente; contemporaneamente
svuotare l’immunotubo e saturarlo completamente con latte 2%.
8. Inoculare 1 colonia di DH5αF' da piastra fresca in 5 ml di 2xYT (DO600 iniziale =
0.05). Far crescere in agitazione a 37°C fino a DO600 = 0.5.
9. Al termine della saturazione svuotare l'immunotubo e aggiungere 500 µl - 1 ml
(pari al volume usato per il coating) dei fagi saturati in latte.
10. Incubare in rotazione per 30' e fermo 1h 30' a T ambiente.
11. Svuotare l’immunotubo e fare 5 lavaggi con PBS 1X - Tween 0.1% e 5 con PBS
1X.
12. Svuotare l’immunotubo e mettere 500 µl - 1 ml di DH5αF' a DO600 = 0.5.
13. Lasciare infettare per 45' a 37°C.
14. Piastrare su piastre 2xYT + Amp 1% + glucosio 1%: 200 μl di DH5αF' per
controllare l’assenza di contaminazioni; 500 µl - 1 ml delle cellule DH5αF'
infettate coi fagi (1° output); una diluizione per calcolare la titolazione della 1°
selezione.
15. Far crescere le piastre O/N a 37°C.
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