Appunti Biochmica Applicata CTF - Capitolo1 - Omero

La procedura per la cromatografia di affinità è del tutto simile aquella usata nelle altre cromatografie liquide. La colonnacromatografica viene impaccata con la matrice a cui è legato illigando; quindi viene equilibrata con un tampone che favorisce ilmassimo di interazione con la macromolecola da purificare. Una voltaapplicato il campione, la colonna viene lavata con lo stessotampone per allontanare i composti contaminanti legatiaspecificamente, poi si opera una eluizione che può essere specificao aspecifica.L’eluizione aspecifica avviene cambiando il pH o la forza ionica: unavariazione di pH provoca una dissociazione dei gruppi del ligando odella macromolecola coinvolti nel loro attacco; una variazione dellaforza ionica, non necessariamente accompagnata da una di pH, provocaanch'essa un'attenuazione del legame tra proteina e ligando;solitamente si usa a questo scopo NaCl 1 M. La glicina in HCl a pH 2-3 è l'eluente di elezione ad esempio per rompere l'interazioneantigene-anticorpo, in questo caso l'anticorpo viene denaturatoreversibilmente.L’eluizione specifica comporta l'aggiunta di ligando libero neltampone di eluizione, ma questa soluzione può essere molto costosa ese il legame è piuttosto forte possono essere necessarie elevateconcentrazioni di ligando libero. Il materiale così eluito conterràanche gli agenti impiegati per l'eluizione che dovranno esseresuccessivamente rimossi. Nel caso di enzimi, l'eluizione specifica siha per aggiunta di substrato o inibitori reversibili oppure peraggiunta di composti dotati di maggiore affinità per il ligando.