Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Probenmaterial von ...

Anhang
H2DCFDA-Vorbereitung
Stammlösung – 1,2 mg lösen in 25 µl DMSO
Diese 25 µl in 25 ml Aqua Bidest. lösen (Stammlösung mit Konzentration von
100 µM)
Herstellung des Endvolumens mit PBS:
5 µM Stammlsg. – 200 µl der Stammlsg. in 4 ml PBS
10 µM Stammlsg. – 400 µl der Stammlsg. in 4 ml PBS (Endvol.)
20 µM Stammlsg. – 800 µl der Stammlsg. in 4 ml PBS
Die Zellen wurden 24 Stunden in den 24 Well plates inkubiert bei einer Konzentration
von 400 000 Zellen pro Well. Anschließend wurden die Zellen gegenüber den verschiedenen
Konzentrationen von H2O2 für 30 Minuten exponiert. Danach wurde das
H2O2 entfernt, die Zellen mit PBS gewaschen, die drei verschiedenen Konzentrationen
des H2DCF-DA hinzugegeben und 20 Minuten inkubiert. Anschließend mussten
die Zellen mit PBS gewaschen und in jeweils 200 µl PBS resuspendiert werden. Die
Suspension wurde in 96er black Wellplatten gefüllt und es erfolgte die Messung an
einem ELISA Plattenleser (Genios TECAN).
Da die Zellen eine starke Radikalbildung zeigten, konnte der Versuch mit den 3T3-
Zellen durchgeführt werden.
2.5 Messung der Apoptose mittels Annexin V-FITC
(Anleitung aus PN IM2375 – 20 Tests –übersetzt aus dem Englischen)
Reagenzien:
1 Ampulle Annexin V-FITC, gebrauchsfertig; flüssig; 100 µl, enthält 1 mg/ml BSA
1 Ampulle 10x konzentrierter Bindungspuffer,; flüssig; 1,7 ml
1 Ampulle Propidiumiodid, rotes Pulver; 250 µg
Fluoreszenz:
Annexin V-FITC:
Absorptionsmaximum: 492 nm
Emissionsmaximum: 520 nm
Propidiumiodid:
Absorptionsmaximum: 370 nm, 520 nm
Emissionsbreite: 560-680 nm
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