Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Probenmaterial von ...

Material und Methoden
3.2.3 Kryokonservierung und Rekultivierung von Zellen
Auftauen von Zellen
Die Kryoröhrchen mit den 3T3-Zellen wurden aus dem flüssigen Stickstoff genommen
und im Wasserbad bewegt, bis sich die Eisklümpchen gelöst hatten. Unter der
sterilen Werkbank wurden die Röhrchen von außen mit 70-prozentigem Ethanol desinfiziert.
In 10 ml Zentrifugenröhrchen wurden 8 ml vorgewärmtes Medium vorgelegt
und der Inhalt der Kryoröhrchen in die Röhrchen überführt. Durch das Zentrifugieren
bei 160 x g für 5 Minuten sollte das noch vorhandene Einfriermedium von den Zellen
getrennt werden. Nach dem Abpipettieren des Überstands im Zentrifugenröhrchen
konnten die 3T3-Zellen in dem Kulturmedium resuspendiert und in vorbereitete Kulturflaschen
(25 cm² mit 5 ml Medium) gegeben werden.
Einfrieren von Zellen
Um die Bildung schädigender Eiskristalle beim Einfrieren der Zellen zu verhindern,
sollte dem Einfriermedium 5 bis 10-prozentiges Dimethylsulfoxid (DMSO) und 20-prozentiges
FKS hinzugefügt werden. Anschließend musste das Medium auf Eis gelegt
und im Kühlschrank auf 0 °C abgekühlt werden. Wie bereits bei der Kultivierung von
Zellen beschrieben, wurde zur Vorbereitung für das Einfrieren das Kulturmedium aus
den Kulturflaschen entfernt und die 3T3-Zellen mit PBS gewaschen. Nach Zugabe
von Trypsin und einer Einwirkzeit von ca. 25 Sekunden musste das Trypsin verworfen
werden und die Kulturflaschen für 5 Minuten im Brutschrank inkubieren. Hatten
sich die 3T3-Zellen vom Boden der Kulturflasche gelöst, konnten sie mit etwa 10 ml
Kulturmedium resuspendiert, die Zellzahl mittels Hämozytometer bestimmt und anschließend
für 5 Minuten bei 160 x g zentrifugiert werden. Nach dem Verwerfen des
Überstandes, erfolgte die Resuspension des Zellpellets mit dem gekühlten Einfriermedium.
Es wurden 1,8 ml der Zellsuspension in vorgekühlte Kryoröhrchen mit einer
Zelldichte von etwa 1,5 bis 2 x 10 6 Zellen (ca. 1 Million Zellen pro ml) pipettiert. Der
Einfrierprozess erfolgte zunächst für ein bis zwei Stunden bei -20 °C. Als die Kryoröhrchen
tief gefroren waren, wurden sie für maximal 24 Stunden bei -80 °C aufbewahrt.
Am nächsten Tag konnten die Röhrchen in Flüssigstickstoff (-196 °C) überführt
werden.
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