Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Probenmaterial von ...

Material und Methoden
Zellen ist das Phosphatidylcholin zum überwiegenden Teil nur auf der äußeren Seite
der Zellmembran, das PS nur auf der Innenseite der Membran zu finden [van Engeland
et al., 1998]. Setzt die Apoptose ein, kommt es zu einer Kondensation und
Schrumpfung der Zelle mit Auflösung der Zellmembran, wie es in Abb. 20 dargestellt
ist. Zu Beginn der Apoptose wird das PS auf die Außenseite der Zellmembran, in
Abb. 21 veranschaulicht, verlagert. Zum Nachweis der Apoptose kann man Annexin
V verwenden. Dieses Protein bindet, in Gegenwart von Ca 2+ - Ionen, spezifisch
an PS.
Abb. 21:
Schematische Darstellung der Bindung
von Annexin V-FITC an Phoshatidylserin
(hier orange markiert) bei einer
apoptotischen Zelle [nach van Engeland
et al., 1998].
Da an das Annexin V der Fluoreszenzfarbstoff FITC gebunden ist, können die apoptotischen
Zellen im Durchflusszytometer nachgewiesen werden.
Um frühapoptotische von spätapoptotischen und nekrotischen Zellen unterscheiden
zu können, muss gleichzeitig eine Färbung mit Propidiumjodid (PI) und Annexin V
erfolgen. Werden die Zellen nekrotisch, wird die Membran durchlässig, das PI dringt
in die Zellen ein und färbt deren DNA. Somit kann auch das Annexin V in die Zellen
eindringen und sich an die Innenseite der Zellen binden. Zellen, die sich im Frühstadium
der Apoptose befinden, werden nur mit Annexin V positiv angefärbt. Befindet
sich die Zelle bereits im Stadium der späten Apoptose, wird sie sowohl mit Annexin V
als auch mit PI gefärbt. Nekrotische Zellen werden überwiegend mit PI gefärbt und
sind erscheinen Annexin V-negativ, da das Annexin V-FITC Signal gegenüber dem
roten PI-Signal deutlich abgeschwächt ist (vgl. auch Abb. 23) [Vermes et al., 1995].
Probenvorbereitung
Je 300 000 Zellen wurden in 12,5 cm² große Kulturflaschen eingesät und 24 Stunden
inkubiert. Die Exposition der Zellen erfolgte gegenüber den Substanzen Krokydolith,
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