Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Probenmaterial von ...

Material und Methoden
ne maximale Aufnahme von Trypan Blau erfolgt bei einem pH-Wert von 7,5. Zudem
sollte sich im Medium keine Serumsubstanz mehr befinden, da sich mit steigender
Serumkonzentration die Anzahl gefärbter Zellen vermindert. Dies würde eine Lebensfähigkeit
der Zellen vortäuschen. Der Trypan Blau-Färbetest wird angewendet zur
Bestimmung des Verhältnisses zwischen vitalen und apoptotischen Zellen. Vitale Zellen
mit intakter Zellmembran nehmen den Farbstoff nicht auf und bleiben weiß. Da es
bei apoptotischen Zellen zu einer Zerstörung der Membran kommt, kann der Farbstoff
in die Zellen eindringen und färbt das Zytoplasma blau. Weil Trypan Blau ein zytotoxischer
Farbstoff ist und ein Absterben vitaler Zellen bewirkt, müssen die Zellen
innerhalb kürzester Zeit ausgezählt werden. Andernfalls kommt es zu einem Anstieg
der als tot gezählten (apoptotischen oder nekrotischen) Zellen.
Vorbereitung:
Für das Experiment wurden ca. 400 000 Zellen/12,5 cm² Kulturflasche eingesät und
24 Stunden inkubiert. Danach erfolgte die Exposition gegenüber den Faser- und Partikelproben
(0,5; 1; 5; 10; 50; 100; 200 µg/cm²) über einen definierten Zeitraum (24;
48; 72 Stunden). Damit nach der Exposition ein Absinken der Partikel auf den Zellrasen
gewährleistet werden konnte, wurden die Zellen auf einen im Inkubator befindlichen
Kleinschüttler (IKA-VIBRAX, Staufen) mit sehr geringer Bewegungsstufe gestellt.
Durchführung:
Die Zellen wurden, wie bereits unter Abschnitt 3.2.2 beschrieben, für die Trypsinierung
vorbereitet. Nach dem Ablösen der Zellen vom Boden der Kulturflaschen wurden
sie in PBS aufgenommen und gut resuspendiert. Ein Verhältnis von 500 µl Zellsuspension
und 500 µl Trypan Blau wurde gemischt. Im Anschluss daran mussten
die Zellen für 4 Minuten im Brutschrank inkubiert werden. Danach erfolgte das Auszählen
der Zellen im Hämozytometer. Lebende Zellen blieben weiß, tote Zellen wurden
blau angefärbt, wobei auch nur schwach blau gefärbte Zellen als tot betrachtet
wurden. Bei 10-facher Vergrößerung erfolgte das Auszählen von 4 Großquadraten.
Der Prozentsatz an lebenden Zellen wurde nach folgender Formel berechnet.
ungefärbte Zellen
% lebende Zellen =
x 100
ungefärbte + gefärbte Zellen
Aus den vier Ergebnissen wird der Mittelwert gebildet.
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