Elektronenmikroskopische Untersuchungen an Probenmaterial von ...
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Material und Methoden<br />
Toner, Carbon black und Tit<strong>an</strong>dioxid mit einer Konzentration <strong>von</strong> 10 µg/cm² sowie<br />
Chrysotil mit einer Konzentration <strong>von</strong> 5 µg/cm².<br />
Als Positivkontrolle bei der Apoptosemessung wurde das Zytostatikum Cisplatin<br />
(SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) verwendet mit einer Konzentration <strong>von</strong><br />
100 µM je 12,5 cm² Kulturflasche [Berechnung im Anh<strong>an</strong>g 2.2].<br />
Die Fasern und Partikel wurden 24 Stunden auf den Zellen belassen, während die<br />
Kulturflaschen im Inkubator auf dem Kleinschüttler st<strong>an</strong>den. D<strong>an</strong>ach mussten die Zellen<br />
mit PBS gewaschen, mit Trypsin abgelöst und eine Zellsuspension mit PBS hergestellt<br />
werden. Da für die Durchflusszytometrie nicht mehr als 100 000 Zellen benötigt<br />
wurden, mussten die Zellen im Hämozytometer gezählt werden. Die Zellsuspension<br />
wurde in Röhrchen, die sich speziell für die Analyse in der Durchflusszytometrie<br />
eignen, überführt und für 5 Minuten bei 500 x g und 4 °C zentrifugiert. Der Überst<strong>an</strong>d<br />
wurde verworfen und das Zellpellet in 100 µl eiskaltem Bindungspuffer resuspendiert<br />
[zur Herstellung des Bindungspuffers vgl. Anh<strong>an</strong>g 2.5]. Nach der Zugabe <strong>von</strong> 5 µl der<br />
Annexin V-FITC-Lösung zur Zellsuspension inkubierten die Zellen 10 Minuten im<br />
Dunkeln. D<strong>an</strong>ach mussten 2,5 µl des PI zur Zellsuspension hinzugefügt, die Lösung<br />
vorsichtig gemischt und erneut für 10 Minuten im Dunkeln inkubiert werden. Die Inkubation<br />
der Zellen mit Annexin V und PI sollte auf Eis erfolgen, um weitere Reaktionen<br />
zu verhindern. Im Anschluss wurden 400 µl des eiskalten Bindungspuffers zu<br />
den Präparaten hinzugefügt und vorsichtig gemischt. Innerhalb <strong>von</strong> 30 Minuten<br />
mussten die Zellpräparate mit der Durchflusszytometrie <strong>an</strong>alysiert werden [vgl. Anh<strong>an</strong>g<br />
2.5]. Die Analyse der Messwerte erfolgte mit dem Programm „Expo 32 ADC<br />
XL 4 Color“.<br />
Ablauf der FACS – Analyse<br />
Für die <strong>Untersuchungen</strong> wurde ein FACSSc<strong>an</strong>® -Gerät der Firma Beckm<strong>an</strong> Coulter<br />
(Coulter Epics XL MCL, Coulter Corporation, Miami, USA) verwendet. Die Abkürzung<br />
FACS bedeutet Fluorescence Activated Cell Sorting oder auch Fluoreszenzaktivierter<br />
Zellsortierer. Das Prinzip der FACS-Analyse wird in Abb. 22 dargestellt.<br />
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