View/Open - JUWEL - Forschungszentrum Jülich

Mesenchymale Stammzellen (MSC) aus Nabelschnurblut
Nabelschnurblutproben wurden ebenso entnommen und behandelt wie für die Präparation
von HSC beschrieben. Für die Gewinnung von MSC aus Nabelschnurblut wurden entweder
MNC nach der Dichtegradientenzentrifugation oder der Durchlauf der MACS-Aufreinigung (s.
3.3.1) verwendet. Diese Proben wurden auf Zellkulturflaschen oder –platten ausgesät, wofür
verschiedene Medien verwendet wurden (s. 4.1.1). Die Zellen wurden für 2 Tage im
Brutschrank inkubiert, anschließend das Medium abgenommen, die adhärent gewordenen
Zellen mit PBS gewaschen und mit frischem Medium versehen. Es folgte weitere Inkubation
im Brutschrank mit wöchentlichen Medienwechseln. Da in keinem Experiment die Konfluenz
der Zellen erreicht wurde, mussten keine Passagen durchgeführt werden.
Mesenchymale Stammzellen (MSC) aus Knochenmark
Die Methoden und Medien für die Präparation von MSC aus Knochenmark wurden von
Claudia Lange (AG Professor Zander, Einrichtung für Knochenmarktransplantation,
Universitätsklinikum Hamburg-Eppendorf) übernommen. Auch die Knochenmarkproben
wurden freundlicherweise von diesem Institut zur Verfügung gestellt. Heparinisiertes
Knochenmark wurde 1:2 mit PBS verdünnt, gemischt und anschließend auf 15 mL Ficoll
geschichtet. Die Proben wurden bei 800 g für 20 min bei Raumtemperatur ohne Bremse
zentrifugiert. Durch die Zentrifugation bildeten sich eine klare Oberphase, eine weißliche, die
MNC beinhaltende Interphase (= "buffy coat") und eine erythrozytenhaltige Unterphase. Die
zellhaltige Interphase wurde mit einer 5-mL-Einwegpipette vorsichtig abgesaugt und in ein
frisches Reaktionsgefäß überführt. Die Zellen wurden 2 – 3-mal mit PBS gewaschen und
jeweils bei 200 g für 10 min bei Raumtemperatur abzentrifugiert. Danach wurde das
Zellpellet in 5 mL frischem Medium (s. Tabelle M-1) aufgenommen und eine Probe für die
Zellzahlbestimmung entnommen. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 4x10 5 Zellen/cm 2
auf Zellkulturflaschen ausgesät und für zwei Tage im Brutschrank inkubiert. Anschließend
wurde das Medium mit den nicht adhärierten Zellen aus den Flaschen entfernt, die
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