View/Open - JUWEL - Forschungszentrum Jülich

Zellen abgenommen, die Vertiefungen mit PBS gewaschen und eine Zellsuspension mit
1x10 6 aus peripherem Blut gewonnenen MNC (peripheral blood mononuclear cells = PBMC)
in je 500 µL IMDM mit 10 % FCS pro Vertiefung ausgesät. Als Negativkontrolle wurde eine
Vertiefung verwendet, in der keine Feederzellen ausgesät worden waren, die aber über
Nacht mit demselben Medium inkubiert worden war wie die Vertiefungen mit Feederzellen. In
diese Vertiefung wurde dieselbe Zellzahl PBMC gesät wie in die übrigen Vertiefungen. Als
Positivkontrolle diente eine Vertiefung, die ebenso behandelt wurde wie die Negativkontrolle
und in die zusätzlich zu den PBMC Phytohämagglutinin-Stammlösung (0,1 µg/µL in PBS)
gegeben wurde, so dass eine Endkonzentration von 2 µg/mL Phytohämagglutinin im Medium
erreicht wurde. Die Zellen wurden dann für 4 Tage im Brutschrank inkubiert.
Tabelle M-8: Antikörpercocktail für Färbung von T-Zellen nach Immunstimulationsexperiment
Probe FITCkonjugierter
Antikörper
PEkonjugierter
Antikörper
PE-Cy5konjugierter
Antikörper
µL
Antikörper je
Ansatz
1 IgG1κ IgG1κ IgG1κ 5 35
2 anti-CD8 anti-CD4 anti-CD3 5 35
3 anti-CD69 anti-CD25 anti-CD3 5 35
4 anti-CD69 anti-CD71 anti-CD3 5 35
µL PBS je
Ansatz
Am fünften Tag wurde das Medium mit den in Suspension befindlichen Zellen aus der Platte
abgenommen und gesammelt. Die Vertiefungen wurden einmal mit PBS gewaschen und die
Waschlösung mit dem zuvor abgenommenen Medium vereinigt. Die Proben wurden
abzentrifugiert (200 g, 10 min, Raumtemperatur) und die Pellets in je 1 mL PBS
aufgenommen. Die Zellsuspension wurde zu je 250 µL auf FACS-Röhrchen verteilt und
erneut mit PBS gewaschen. Nach der Zentrifugation (200 g, 10 min, Raumtemperatur)
wurden die Zellpellets in einer zuvor vorbereiteten Antikörperlösung (in PBS + 5 % FCS;
siehe Tabelle M-8) resuspendiert und für 20 min bei 4°C im Dunkeln inkubiert. Anschließend
wurden die Zellen in 1 mL PBS gewaschen und die Pellets in jeweils 500 µL FACSfix
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