View/Open - JUWEL - Forschungszentrum Jülich

Am folgenden Tag (d. 0 oder d. 7 des jeweiligen Kokulturversuchs) wurden die
hämatopoetischen Zellen auf die vorbereiteten Platten in 6 aufeinanderfolgenden
Verdünnungsschritten ausgesät (Zellzahlen/Vertiefung s. Tabelle M-6). Die Zellsuspension
hierfür wurde ebenfalls in CAFC-Medium hergestellt und mit einem Volumen von 100
µL/Vertiefung auf die Platten verteilt. Die Platten wurden für 6 Wochen im Brutschrank
inkubiert, wobei einmal wöchentlich die Hälfte des Mediums in jeder Vertiefung durch
frisches Medium ersetzt wurde. Nach dieser Zeit wurde die Anzahl der Vertiefungen
bestimmt, in denen sich kopfsteinpflasterförmige, aus mindestens 6 Zellen bestehende
Kolonien gebildet hatten. Diese wurden als „positiv“, die Vertiefungen ohne diese Kolonien
als „negativ“ bewertet. Aus der Verdünnung und der Anzahl negativer Vertiefungen konnte
die Frequenz der CAFCs in der Ausgangszellsuspension errechnet werden. Dazu wurde die
Anzahl der pro Vertiefung ausgesäten hämatopoetischen Zellen gegen den prozentualen
Anteil der bei dieser Aussaatdichte gezählten negativen Vertiefungen aufgetragen. Aus
diesem Diagramm wurde eine Ausgleichsgerade berechnet, anhand deren Steigung die
Frequenz der CAFC in den ausgesäten Zellen bestimmt wurde.
Tabelle M-6: Zellzahlen und Plattenanzahl für CAFC-Assay
Verdünnungsschritt (Reihe)
Zellen/Vertiefung ausgesät an
d. 0 d. 7
1 243 1215
2 81 405
3 27 135
4 9 45
5 3 15
6 1 5
ausgesäte Platten pro
Versuchsansatz
4 2
73