Jahresbericht 2003 - Leibniz Institute for Age Research

Arbeitsgruppe Diekmann
Forschungsschwerpunkte
1. Struktur, Funktion und Dynamik nukleärer Multiproteinkomplexe
Mitarbeiter: P. Hemmerich, G. Wieland, A. Kießlich, L. Schmiedeberg, E. Kamphausen,
M. Koch, S. Ohndorf, S. Weidtkamp-Peters, S. Orthaus
Finanzierung: BMBF und Haushalt-IMB
Kooperationen: C. Cardoso (MDC, Berlin-Buch), F. Hiepe (Klinische Immunologie,Charité)
A. v. Mikecz (Institut für Umweltmedizinische Forschung, Univ. Düsseldorf)
A. Pombo (MRC Clinical Science Center, London, England)
A. Thiel/A. Radbruch (Deutsches Rheuma-Forschungszentrum, Berlin)
H. Will/T. Hofmann, Ph.D. (HPI, Hamburg)
G. Maul (The Wistar Institute, PA, USA)
1.1. Der Centromer/Kinetochor-Komplex
Das Centromer ist ein chromosomaler Abschnitt, der für die getreue Verteilung des
Erbmaterials bei der Mitose und Meiose von eukaryontischen Zellen verantwortlich ist. In
neoplastischen Zellen verändert sich die Zahl und die Struktur von Chromosomen, begleitet
von Struktur- und Funktionsfehlern der Centromere. Außerdem sind Centromere spezifische
Targets bei bestimmten viralen Infektionen (z. B. Herpes und SV-40). Die viralen Proteine
binden direkt an Centromer-Proteine, bewirken deren proteasomalen Abbau und
verursachen dadurch die Inaktivierung der Centromer-Struktur. Aus der Analyse der
molekularen Verwandtschaft von Centromer-Proteinen verschiedener Spezies erhoffen wir
uns weitere Einblicke in die Struktur und Funktionsweise von eukaryontischen Centromer-
Komplexen.
Die Centromer-Funktionen in verschiedenen Spezies sind auf der Ebene der jeweiligen DNA/
Multiprotein-Komplexe weitgehend konserviert. Eine logische Erweiterung dieser Beobachtung
ist, dass vielleicht auch die molekularen Mechanismen konserviert sind, die der
Centromer-Funktion zugrunde liegen. Von diesem Konzept geleitet verglichen wir die
Centromere von Hefe (Saccharomyces cerevisiae, S.c.) und Mensch. Uns interessiert auch
die Verwandtschaft zu bakteriellen Kinetochor-Proteinen, die an der Segregation von Low-
Copy-Plasmiden beteiligt sind.
Von zentraler Bedeutung ist für uns die Frage, welche Proteine am Aufbau des Kinetochors
beim Menschen beteiligt sind und wie diese Proteine miteinander wechselwirken. Wir
klonierten deshalb die fundamentalen vier Kinetochor-Proteine CenP-A, -C, -H und –I als
auch ihre Subdomänen in E .coli, um die Wechselwirkung der so exprimierten Proteine
untereinander zu studieren und nach Wechselwirkungs-Partnern in menschlichen
Zellextrakten zu suchen. Weitere Kinetochor-Proteine werden nun ebenfalls kloniert und
untersucht.
Parallel haben wir diese Proteine und ihre Subdomänen in die Jäger-und-Beute-Yeast-2-
Hybrid-Vektoren kloniert und werden sie nun in Zusammenarbeit mit der Gruppe von Prof.
Wancker am MDC, Berlin, auf ihre Wechselwirkung untereinander und mit anderen
klonierten menschlichen Proteinen untersuchen.
Außerdem klonierten wir diese Proteine zu Fusionen mit Green Fluorescent Protein (GFP)
und den Farbvarianten CFP und YFP. Diese fluoreszierenden Proteine werden in lebenden
menschlichen Zellen exprimiert. Wir untersuchen die Dynamik dieser Proteine gebunden im
Komplex und außerhalb des Komplexes im Nukleoplasma und Cytosol (mittels FRAP und
FCS). Mittels FRET arbeiten wir an der Nachbarschafts-Beziehung dieser Kinetochor-
Proteine untereinander und zu Histonen sowie HP1, Proteine, die wir ebenfalls als
Fusionsproteine mit GFP, CFP und YFP konstruierten.
Zu CenP-H lagen bisher keine Knock-Down-Daten zu menschlichen Zellen vor (publiziert
war nur Huhn). Wir untersuchten die Funktion von CenP-H in menschlichen Zellen nach
Herunterregulierung durch Zugabe von CenP-H-RNAi. Im Gegensatz zum Huhn scheinen im
Menschen die Zellen nach CenP-H-RNAi-Behandlung nicht in der Mitose arretiert zu werden.
Uns interessiert auch, welches molekulare Signal vom Kinetochor erkannt wird und den Ort
der DNA-Komplex-Bildung definiert. Wir studieren deshalb den Zeitpunkt der Kinetochor-
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