Jahresbericht 2003 - Leibniz Institute for Age Research

Arbeitsgruppe Görlach
Schädigungen, kann die Oxidation von Methioninseitenketten durch Methionin-sulfoxid–
Reduktasen (MSRn) repariert werden. MSRn verlängern die Lebensspanne transgener
Tiere. MSRn katalysieren Thioredoxin–abhängig die Reduktion von MetSO zu Met. Das
ubiquitäre Vorkommen dieser Enzyme deutet auf deren essentielle Funktion in der Abwehr
von oxidativen Schäden hin. Der Abbau von ROS durch zyklische Interkonversion von
oxidierten/reduzierten Met–Seitenketten und eine Regulation von Proteinen über den Oxidationszustand
von Met–Resten stellen weitere wichtige Funktionen von MSRn dar. Ziel
dieser Arbeiten ist die Bestimmung der Struktur von humanen B–Typ Methioninsulfoxid–Reduktasen
(hMSRB1 und 2) und die Charakterisierung ihrer Wechselwirkung mit Substratpeptiden
bzw. –proteinen mittels NMR–Spektroskopie. Daher sollen hMSRB–Interaktionen
mit Substratpeptiden bzw. –proteinen charakterisiert werden und, wenn möglich, die Struktur
eines hMSRB–Substrat–Komplexes bestimmt werden, um spezifische Protein–Protein–Interaktionen
abzuleiten. Als Substrate bieten sich das Modellpeptid KIFM(O)K und das NMR–
spektroskopisch gut charakterisierte Calmodulin(–Domänen/–Peptide) an. Für Calmodulin ist
bekannt, dass seine regulatorische Aktivität auf die Ca–ATPase durch Oxidation zweier C–
terminaler Met–Reste reversibel beeinflusst werden kann.
In Zusammenarbeit mit der AG Prof. Heinemann wurden vorhandene cDNA–Klone von
hMSRB1 und hMSRB2 für die Expression und Reinigung modifiziert. Erste Analysen zeigten,
dass die Deletion des Gly-reichen N–Terminus von hMSRB1 und das Entfernen nicht-nativer
terminaler Sequenzbereich von hMSRB2 die Löslichkeit und Stabilität in Lösung wesentlich
erhöht. Die Reinigung der Proteine erfolgt über Affinitäts–Chromatographie und Gelsieb–
Chromatographie. Humane MSRB wurden in 15 N– und 13 C/ 15 N–markierter Form exprimiert,
gereinigt und für die NMR–Spektroskopie bereitgestellt. Die gute Signal–Dispersion in
1 H, 15 N–HSQC–Spektren deuteten auf eine gefaltete Struktur beider Proteine hin, allerdings
wurde eine viel größere Anzahl von Amid–Resonanzen beobachtet als aus der Anzahl der
Aminosäuren zu erwarten war. Da hMSRB2 unter den bisher getesteten Bedingungen zur
Aggregation neigt, wurden die Untersuchungen zunächst mit MSRB1 fortgesetzt. 1 H-
Spektren von hMSRB1 zeigten Hochfeld–Resonanzen bei –5ppm, die auf eine Koordination
von (paramagnetischem) Metall hindeuteten. In Zusammenarbeit mit Dr. Tröger (Inst. für
Physik, Univ. Leipzig) wurde eine PIXE– (proton induced x-ray emission) Analyse vorgenommen.
Diese zeigte, dass Co, Zn und Fe (aber nicht Ni) an hMSRB1 gebunden sind. Von
diesen konnte nur Fe durch Chelex aus dem Protein entfernt werden. Diese Übergangsmetalle
(wie auch weitere, z.B. Ni, Mn, Mo) werden in µM Konzentrationen im Medium als
Spurenelemente eingesetzt. Das Medium wurde so modifiziert, dass lediglich Zn während
der Expression vorhanden war. Dies führte zu einer Reduktion der Expressionsausbeute auf
etwa die Hälfte. Von unter diesen Bedingungen exprimiertem hMSRB1 aufgenommene
1 H, 15 N–HSQC–Spektren zeigten die erwartete Anzahl von Kreuzsignalen, die jetzt eine
homogene Struktur der hMSRB1 in Lösung andeuten. Von einer unter diesen optimierten
Bedingungen exprimierten und gereinigten 15 N–markierten MSRB1–Probe wurde ein 15 N-
Datensatz aufgenommen (2D- 15 N-NOESY, 3D- 15 N-NOESY, 3D- 15 N-HNHA, 3D- 15 N-TOCSY).
Eine erste 200µM 13 C/ 15 N–markierte Probe von MSRB1 ergab ein zufriedenstellendes
1 H, 13 C–Korrelationsspektrum, sodass davon ausgegangen wird, dass eine Aufklärung der
hMSRB1–Raumstruktur möglich ist. Mit diesen Arbeiten wurde begonnen.
1.3. Steroidmetabolisierende Enzyme
Mitarbeiter: M. Nestler, C. Kamperdick, A. Heller, M. Baum, M. Görlach
Finanzierung: BMBF 0312704E (JCB)
Kooperationen: J. Sühnel, M. Zacharias, IMB/Intl Univ. Bremen;
A. Hillisch, EnTec, Jena, F. Pineda, Jenapharm;
V. Bähr, Klinikum Benjamin Franklin, Berlin
Ein Weg der Signalübertragung bei höheren Lebewesen führt über die endokrine Hormonwirkung.
Diese Hormone gelangen über den Blutkreislauf vom Ort ihrer Biosynthese zum
Erfolgsorgan. Besonders Steroidhormone sind dabei an Transportproteine gebunden oder
liegen in kovalent modifizierten Transportformen vor. In den Zielorganen werden sie durch
Enzyme in wirksame Hormone überführt. Die Absenkung oder Anhebung von Steroid-
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