„Einfluss der elektrischen Hochfrequenzstimulation des Nucleus ...

Methoden 52
2.6.2 Probenaufarbeitung
Der bis zur Durchführung der HPLC bei -80°C gelager te Nucleus caudatus
der Ratte wurde in einen gekühlten 1ml-Hand-Homogenisator gegeben, das
Gewicht ermittelt und anschließend mit einer 50fachen Menge an
Phosphatpuffer und 1/10 der Puffermenge an Perchlorsäure versetzt und
eine Minute homogenisiert. Dieses Gemisch wurde 10 Minuten bei 4°C und
1200xg zentrifugiert und der Überstand, der das Extrakt darstellt, in zwei
Eppendorf-Gefäße überführt. Durch Zentrifugation und Zugabe der
Perchlorsäure wurden die Neurotransmitter von dem Hirn-Gewebe gelöst
und lagen nun in reiner Form im Extrakt vor. Dieses Extrakt wurde direkt in
die HPLC-Anlage injiziert, um die Neurotransmitter Dopamin, DOPAC, HVA,
Serotonin und HIAA zu messen.
Für die Analyse von Glutamat und GABA musste das Extrakt zunächst
derivatisiert werden. GABA und Glutamat sind Aminosäuren, die außerhalb
ihres isoelektrischen pH-Wertes in polarer Form vorliegen. Um eine optimale
Adsorption an die feste Phase zu erreichen und spätere elektrochemische
Detektion zu ermöglichen, ist eine Derivatisierung der Substanzen nötig. Eine
stabile und sensitive Derivatisierungsmethode für die Analyse von GABA und
Glutamat ist die ortho-Phthaldialdehyd(OPA)-Sulfit-Derivatisierung nach
Smith und Sharp [98]. Bei dieser Methode wurden 100µl des Extraktes mit
2µl OPA versetzt und 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert.
Anschließend konnte diese so behandelte Lösung in die HPLC-Anlage
injiziert werden.
Die einzelnen Neurotransmitter wurden nun elektrochemisch detektiert. Der
Computer stellte die Peaks der einzelnen Komponenten dar und mit Hilfe der
vorher aufgezeichneten Peaks der Standards konnte jeder Neurotransmitter
seinem Peak zugeordnet werden. Durch Vergleiche mit den Standards
konnten die Konzentrationen der zu messenden Substanzen ermittelt
werden.