Promotion Wiebke Winkens Abgabeversion 2 - RWTH

3.7.1.4 Kommerzielle cDNA Proben
Material und Methoden
Für die Untersuchungen wurden kommerziell erhältliche cDNA-Proben der Firma
Clontech erworben.
3.7.2 DNA-Isolierung
3.7.2.1 DNA-Isolierung aus Gewebe und Zelllinien
Die DNA-Extraktion erfolgte unter Beachtung der Herstellerangaben mit dem QIAamp
DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden). Für die Isolation von genomischer DNA wurden 10-15
mg Gewebe mit 180 µl ATL-Puffer und mit 20 µl einer Proteinase-K-Lösung versetzt.
Nach einer Stunde Inkubationszeit bei 56 °C wurden 200µl ATL-Puffer zugesetzt und
der Ansatz wurde durch Inkubation bei 70° C für 10 Minuten lysiert (Zugabe von 20 U
RNAse optional). Die DNA wurde durch die Zugabe von 200 µl 100% Ethanol
präzipitiert, auf eine QIAamp-Säule gegeben und abzentrifugiert. Anschließend wurde
die in der Säule gebundene DNA zweimal mit 500 ml AW1- und AW2-Puffer
gewaschen. Durch die Zugabe von 200 ml Tris-Puffer (pH 8,5) wurde die DNA eluiert
und bei -20 °C gelagert.
Für die DNA-Isolation aus Zelllinien wurden 5x10 6 Zellen trypsiniert und pelletiert, mit
PBS gewaschen und in 200 µl PBS resuspendiert. Durch die Zugabe von 20 µl
Proteinase-K Lösung in 200 ml AL-Puffer und einer Inkubation bei 56 °C für 10
Minuten erfolgte die Zelllyse. Nach einem 5 Minuten RNAse-A-Verdau (20 Einheiten)
bei Raumtemperatur, um kopräzipitierende RNA zu verdauen, erfolgte die DNA-
Extraktion analog zum Gewebe.
3.7.3 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, kurz PCR) ist ein
Verfahren, das für die Vervielfältigung von DNA beziehungsweise cDNA genutzt wird.
Ein PCR-Ansatz setzt sich zusammen aus den DNA-Matrizen, die vervielfältigt werden
sollen, den Primern, als Startermoleküle für die DNA-Synthese, den
Desoxyribonukleotiden (dNTPs), als Bausteine für die Bildung der DNA-Kopien, der
Taq-Polymerase, einem hitzestabilen Enzym, welches die Vervielfältigungsreaktion
katalysiert und einem geeigneten Puffer, der die optimalen Bedingungen für die
Reaktion gewährleistet.
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