Promotion Wiebke Winkens Abgabeversion 2 - RWTH

Material und Methoden
der Behandlung von genomischer DNA mit Natrium-Bisulfit kommt es zu einer
Modifikation von unmethylierten Cytosin-Basen. Hierbei werden unmethyliert
vorliegende, einzelsträngig vorliegende Cytosin-Basen durch die katalytische Wirkung
von Bisulfit zu Uracil desaminiert. Es kommt somit zu einer Sequenzänderung. Cytosin-
Basen, die am C5-Atom eine Methylgruppe tragen (5-Methylcytosin) sind nicht
konvertierbar. Die Änderung der Sequenz kann durch die methylierungs-spezifische
PCR detektiert werden.
Die Bisulfit-Umwandlung wurde nach Herstellerangaben mit dem DNA Methylation
Kit (Zymo Research, Mannheim) durchgeführt. Im Ansatz wurden 0,5 bis 1 µg DNA
in 45 ml destilliertem Wasser gelöst. Nach Zugabe von 5 µl Dilution-Puffer erfolgte
eine Inkubation von 15 Minuten bei 37 °C. Durch anschließende Zugabe von 100 µl
Conversion-Reagenz und Inkubation bei 50 °C für 12-16 Stunden kam es zur
Sulfonierung der Cytosine am C6-Atom. Im Anschluss kam es zu einer spontanen
Hydrolysierung der Aminogruppe am C4-Atom und somit zur Bildung von
Uracilsulfonat.
Nach Zugabe von 200 µl Binding-Puffer wurde der Ansatz auf eine Säule aufgegeben
und zentrifugiert und gewaschen. Anschließend erfolgte die Desulfonierung der
entstandenen Uracilsulfonate unter basischen Bedingungen durch die Zugabe von 200
µl Desulfonations-Puffer. Nach zwei weiteren Waschschritten wurde die DNA in 20-50
ml Elutions-Puffer eluiert.
Als Resultat lagen nun alle ursprünglich unmethylierten Cytosine der DNA als Uracil-
Basen vor, die ein verändertes Bindungsverhalten zeigen (Komplementär zu Adenin,
statt zu Guanin). Diese unterschiedlichen DNA-Sequenzen, die auf Basis der Cytosin-
Methylierung am C5-Atom entstanden sind, konnten mit diskriminierenden Primern mit
Hilfe der Methylierungs-spezifischen PCR detektiert werden.
3.7.5.2 Methylierungs-spezifische PCR (MSP)
Die methylierungs-spezifische PCR basiert auf einer Methode von Herman et al (1996).
Sie wurde für die Analyse des Promotermethylierungsstatus für das WNT2b-Gen
durchgeführt. Hierbei wurde die PCR-Amplifikation in zwei Ansätzen mit zwei
verschiedenen Primerpaaren durchgeführt. Eines der Primerpaare ist spezifisch für die
methylierte Sequenz (M-Primer), das andere für die unmethylierte Sequenz (U-Primer).
Beide Primerpaare sollten im Wesentlichen dasselbe Amplikon definieren. Die PCR
wurde mit einem Reaktionsansatz von 25 ml durchgeführt.
32