Promotion Wiebke Winkens Abgabeversion 2 - RWTH

3.7.4 Expressionsanalyse mittels Real-Time-PCR
Theoretischer Hintergrund
Material und Methoden
Als quantitative Methode, um die Expressionshöhe einer spezifischen mRNA
bestimmen zu können, wurde in den hier beschriebenen Experimenten die Real-Time-
PCR angewendet. Hierbei wurde, wie auch bei der konventionellen RT-PCR, die zu
untersuchende mRNA zunächst in cDNA umgeschrieben, um dann mit produkt-
spezifischen Primern amplifiziert zu werden. Zusätzlich wurde das entstehende
Amplifikat nach jedem Zyklus über ein Fluoreszenzsignal-übermittelndes System
detektiert.
Im Rahmen der hier beschriebenen Experimente wurde der Light Cycler (Roche
Diagnostics GmbH, Mannheim) als PCR-Gerät und SYBR-Green als Fluorochrom aus
dem Light-Cycler FastStart DNA Master SYBR Green I-Kit (Roche, Mannheim)
eingesetzt. SYBR-Green ist ein Cyanin-Fluoreszenzfarbstoff, der in die Zwischenräume
von doppelsträngiger DNA interkaliert. Durch diese Bindung wird die emittierte
Fluoreszenz bei gleicher Anregungsintensität um ein Vielfaches erhöht. Durch
Anregung mittels eines Lasers kann nach jedem Elongationsschritt der
Fluoreszenzanstieg gemessen werden. Dieser spiegelt die Menge an doppelsträngiger
DNA in der PCR-Reaktion wider und ermöglicht so eine genauere quantitative Analyse
der Menge des entstehenden PCR-Produktes.
Durchführung
Für die Real-Time-RT-PCR-Analyse mit dem Light Cycler DNA Master SYBRGreen I
Kit (Roche Diagnostics) wurde die aus Gewebe synthetisierte cDNA zunächst 1:20 in
Aqua dest. verdünnt, um dann in einer 20 µl-PCR-Reaktion mit den jeweils
entsprechenden Primern eingesetzt zu werden.
Zur Normalisierung der eingesetzten cDNA-Menge wurde das House-Keeping-Gen
Glycerin-Aldehyd-3-Phosphat-Dehydrogenase (GAPDH) in jeder Probe bestimmt. Als
Negativkontrolle, um etwaige Verunreinigungen des Master-Mix ausschließen zu
können, wurde Aqua dest. bei jeder Amplifikation mitgeführt.
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