Promotion Wiebke Winkens Abgabeversion 2 - RWTH

Analyse der relativen Expression
Material und Methoden
Die Quantifizierung basiert auf Berechnung des Schwellenwertes der Fluoreszenz,
Cycle-Threshold oder CT-Wert genannt. Er gibt an bei welchem PCR-Zyklus die
emittierte Fluoreszenz die Hintergrundfluoreszenz signifikant übersteigt. Zum Zeitpunkt
des CT-Wertes ist der Fluoreszenzanstieg exponentiell, ohne dass er von limitierenden
Faktoren wie Primer- oder Nukleotidmangel und Enzyminaktivität eingeschränkt wird.
Die Quantifizierung beruht also auf der Kinetik der PCR-Reaktion und nicht auf der
absoluten Menge.
Für die Quantifizierung der Expression des Zielgens wurden die CT-Werte von Zielgen
und Referenzgen (hier GAPDH als House-Keeping-Gen) von derselben cDNA
zueinander in ein Verhältnis gesetzt. Hierfür wurde zunächst die Differenz der CT-
Werte (∆CT) zwischen Ziel- und Referenzgen für die jeweilige cDNA berechnet:
∆CT = CT Zielgen – CT Referenzgen
Anschließend wurde die ∆CT – Differenz (∆∆CT) zwischen zwei verschiedenen Proben
(zum Beispiel Probe 1 = Normalgewebe; Probe 2 = Tumorgewebe) berechnet:
∆∆CT = ∆CT Probe 1 – ∆CT Probe 2
Zum Schluss wurde die relative Expression, als die x-fache Über- oder Unterexpression
des Zielgens in Probe 2 in Relation zu Probe 1, wie folgt berechnet:
Expressionsstärke = 2 -∆∆CT
Hierbei steht 2-∆∆CT für den „Fold Change“ (FC) der differentiellen Expression.
Methode der relativen Quantifizierung (Fink et al., 1998).
3.7.5 Methylierungs-spezifische PCR
3.7.5.1 Bisulfit-Umwandlung von genomischer DNA aus Gewebeproben
Chemische Basenmodifikationen der DNA können nicht direkt mittels
Amplifikationsreaktionen detektiert werden. Daher stellt die Modifizierung von
genomischer DNA mittels Natrium-Bisulfit (NaHSO3) die Grundlage für die Detektion
von DNA-Methylierung mittels der MSP (Methylierungs-spezifischen PCR) dar. Bei
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