Promotion Wiebke Winkens Abgabeversion 2 - RWTH

4. Ergebnisse
4.1 Semiquantitative Analyse der Frizzled-Expression mittels Real-
Time-RT-PCR in Mammakarzinomen
4.1.1 Analyse der Frizzled-Expression mittels Real-Time-RT-PCR in normalen
Brustdrüsengewebe
Die Beteiligung eines pathologisch deregulierten WNT-Signalweges an der
Karzinogenese wurde bereits für mehrere Tumorentitäten in der Literatur beschrieben
(Yang et al., 2006; Burgess et al., 2011, Fatima et al., 2011). Die Frizzled-Genfamilie
ist hier von besonderer Bedeutung, da sie für Transmembranrezeptoren kodieren, die die
WNT-Liganden binden und für die Signalweiterleitung zuständig sind.
Aus der Überlegung, dass gerade diejenigen Frizzled-Moleküle, die in der normalen
weiblichen Brust exprimiert werden, bei der Kanzerogenese durch Deregulation ein
wichtige Rolle spielen könnten, wurde zunächst eine quantitative Expressions-Analyse
der einzelnen Mitglieder der Frizzled-Genfamilie mittels Real-Time-RT-PCR in
Brustnormalgewebe durchgeführt. Im Brustgewebe stark exprimiert Frizzled-Gene
sollten dann weitergehend detailliert untersucht werden.
Die Expressionen aller zehn Mitglieder der Frizzled-Genfamilie wurden auf jeweils
äquivalente Mengen kommerziell erhältlicher cDNA aus benignem Brustdrüsengewebe
(Firma Clontech) mittels Real-Time-RT-PCR ermittelt. Die in der Arbeitsgruppe bereits
etablierten Frizzled-Gen-Primer wurden so ausgewählt, dass diese Intronüberspannend
sind. Dadurch wurde die Amplifikation von gegebenenfalls vorhandener
kontaminierender genomischer DNA ausgeschlossen.
Als Referenz für die Transkriptmengen-Bestimmung wurde das House-Keeping-Gen
Glycerinaldehyd-3-Phophat-Dehydrogenase (GAPDH) gewählt. Das GAPDH-Gen
kodiert ein zentrales Enzym, das für den Energiestoffwechsel der Zelle wesentlich ist
und wird daher in allen Zellen konstitutiv und ähnlich stark exprimiert. Folglich wird
die GAPDH-Expression oft zu Standardisierung von Transkriptmengen verwendet.
Abb. 4-1 zeigt die relativen Expressionshöhen der Frizzled-Gene 1 bis 10 auf mRNA-
Ebene in normalem Brustdrüsengewebe, normiert auf den Median der einzelnen
Expressionslevel. Hierbei zeigt sich, dass vor allem Frizzled-1 (FZD1), Frizzled-4
(FZD4), Frizzled-6 (FZD6) und Frizzled-10 (FZD10) im normalen Brustgewebe
exprimiert sind, wobei besonders FZD4 eine starke Expression zeigt.
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