Promotion Wiebke Winkens Abgabeversion 2 - RWTH

Material und Methoden
3.7.6 Agarose-Gelelektrophorese zur Auftrennung von Nukleinsäuren
Zur Größen-Auftrennung wurden die DNA-Fragmente mit einem Ladepuffer versetzt
und auf einem 1-2%igen Agarosegel aufgetragen. Als Längenstandard wurde eine
geeignete Basenpaarleiter genutzt. Als Laufpuffer diente ein 1-facher TBE-Puffer bei
einer Spannung von 80 Volt. Während der ungefähr 30 Minuten andauernden
Auftrennung wurden die DNA-Banden durch das im Agarosegel vorhandene
Ethidiumbromid (EtBr) angefärbt (Interkalation des EtBr in die dsDNA). Dabei lagerten
sich die Ethidiumbromidmoleküle an die doppelsträngige DNA an und konnten danach
auf einem UV-Transilluminator sichtbar gemacht werden.
3.7.7 Konzentrationsbestimmung der gewonnen Nukleinsäuren
Die Konzentrationsbestimmungen der Nukleinsäuren erfolgte mit dem
Spektralphotometer NanoDrop® ND1000. Hierfür wurden 1-2 µl einer Nukleinsäure-
Lösung benötigt. Das Messprinzip beruht auf dem Lambert-Beer’schen Gesetz, nutzt
also die spezifische Absorption von Nukleinsäuren bei λ = 260 nm. Die Reinheit der
Probe bezüglich der Protein-Kontaminationen wurde über den Koeffizienten
OD260nm/OD280nm berechnet. Für reine RNA soll dieser Koeffizient ≥ 2 sein. Für
DNA soll dieser Koeffizient bei 1.8 - 2.0 liegen. Die Sensitivität für RNA liegt
zwischen 2 bis 3000 ng/µl, die Sensitivität für dsDNA liegt zwischen 2 bis 3700 ng/µl.
3.8 Statistische Methoden
Die statistischen Analysen wurden mit dem Programm GraphPad Prism5.0
(GraphPadSoftware Inc., La Jolla, CA, USA) durchgeführt. Sämtliche Tests sind
zweiseitig angelegt. Die statistisch signifikante Fehlerwahrscheinlichkeit ist, soweit
nicht anders angegeben, mit p < 0,05 definiert. Die differentielle Expressionsstärke von
zwei unabhängigen Versuchsgruppen wurde mit dem nicht parametrischen Mann-
Whitney-U-Test analysiert.
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