Promotion Wiebke Winkens Abgabeversion 2 - RWTH
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Material und Methoden<br />
Im Folgenden ist ein Standard-Reaktionsansatz der methylierungs-spezifischen PCR<br />
aufgelistet:<br />
2,5 µl MSP-Puffer (1x)<br />
1,25 µl dNTPs (je 25mM)<br />
0,5 µl sense-Primer (U bzw M) (10µM)<br />
0,5 µl antisense-Primer (U bzw M) (10µM)<br />
5-20 ng Bisulfit-konvertierte DNA (1µl)<br />
ad. 20 µl H2O<br />
Überschichtung mit Mineralöl 10 µl<br />
Die PCR wurde als Hot-Start-PCR durchgeführt. Dabei wurde die Polymerase der<br />
Reaktion erst nach der initialen Denaturierung zugegeben. Dadurch wurde ein<br />
unspezifisches Annealing während der Aufheizphase verhindert.<br />
Nach der initialen Denaturierung wurden pro Ansatz 1,25 Einheiten Taq-DNA-<br />
Polymerase in 5 µl H2O der Probe zugegeben.<br />
Initiale Denaturierung 94° C 5 Minuten<br />
Hot Start<br />
(Zugabe der Taq DNA Polymerase<br />
Denaturierung<br />
Anlagerungstemperatur<br />
Elongation<br />
80° C 2 Minuten<br />
94°C 30 Sekunden<br />
60°C 30 Sekunden 36 Zyklen<br />
72°C 30 Sekunden<br />
Finale Extension 72°C 10 Minuten<br />
Kühlen 4°C ∞<br />
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