Es war einmal.. .. eine Zelle und sie wurde nimmermehr gesehen?

Fokussystem. Letzteres orientiert sich an
gut erkennbaren Zelleigenschaften, etwa
dem mehr oder weniger scharfen Umriss
des Zellkerns, um die Fokusebene einzustellen.
Laser-Autofokussysteme sind schnell
und genau, dafür aber nicht immer mit den
verwendeten Mikrotiterplatten kompatibel.
Bild-basierte Systeme arbeiten ebenfalls
exakt, vertrödeln durch die aufwendige
Rechnerei der Software jedoch kostbare
Zeit und bremsen die High-Content-Analyse
hierdurch etwas aus.
Bildanalyse-Pipeline
Laborjournal
7-8/2016
Wirtschaft
Auch bei den Kameras, welche die
optischen Signale des Mikroskops in ein
Bild umwandeln, das schließlich auf dem
Monitor erscheint, existieren zwei unterschiedliche
Systeme: Charge-Coupled-Device
(CCD)-Kameras oder neuerdings Electron-Multiply-(EM)CCD-Kameras
sowie
Complementary-Metal-Oxide-Semiconductor
(CMOS)-Kameras. Einige Hersteller, wie
zum Beispiel Thermo Fisher, bevorzugen in
ihren Systemen CCD-Kameras und begründen
dies mit höheren Quantenausbeuten
und etwas besseren Signal-zu-Rausch-Verhältnissen
im Vergleich zu cMOS-Kameras.
Andere Firmen wie Perkin-Elmer favorisieren
cMOS-Kameras oder bieten, wie zum
Beispiel Molecular Devices, teilweise beide
Alternativen an.
Sind die Bilder der Zellen im Kasten,
geht es an den kniffligsten Teil des
High- Content-Screenings: die Analyse
und Aufbereitung der Bild-Rohdaten. Die
Geräte-Hersteller liefern hierzu meist
ihre firmeneigenen Software-Lösungen.
Viele Forscher verwenden aber auch freie
Bildanalyse-Programme, wie etwa Cellprofiler
oder KNIME, die sie an ihre individuellen
HCS-Experimente anpassen.
Freie wie proprietäre Programme folgen
einer sogenannten Bildanalyse-Pipeline, die
in möglichst kurzer Zeit fehlerfreie, neutral
gewichtete Bilddaten liefern soll. Im ersten
Schritt der Pipeline eliminiert die Software
die gröbsten Schnitzer in den Bildrohdaten,
etwa zu hohes Hintergrundrauschen, Artefakte
oder störende Belichtungseffekte. Anschließend
konzentriert sie sich auf einen
Teilausschnitt, der einzelne Zellen enthält.
Aus diesem entfernt sie Objekte, die für die
weitere Analyse ungeeignet sind, etwa Zellen
in Randzonen des analysierten Sektors.
Erst nach dieser Vorauswahl startet
das Computergehirn mit der eigentlichen
Zellanalyse und erfasst spezifische Zelleigenschaften
wie Morphologie, Textur,
Lichtstreuung oder emittierte Fluoreszenz.
Die hieraus resultierenden Bilddaten werden
schließlich normalisiert und graphisch
dargestellt, zum Beispiel als Heat Map, Linien-
oder Streudiagramm.
Die Pharmaindustrie setzt HCS-Systeme
vor allem bei der immer verzweifelteren Suche
nach neuen Wirkstoffkandidaten und
Leitstrukturen ein, die ihre nur noch spärlich
tröpfelnden Drug-Pipelines wiederbeleben
sollen. Dabei greifen Pharma-Forscher
zunehmend auf klassische phänotypische
Assays beziehungsweise Screens zurück,
die lange Zeit außer Mode waren und von
Zielmolekül-orientierten Ansätzen verdrängt
wurden. Die grundlegende Strategie
phänotypischer HCS-Screens ist im Grunde
simpel: Zunächst entwickeln die Forscher
einen Assay, mit dem sie phänotypische
Veränderungen in den erkrankten Zellen
mit dem HCS-System verfolgen können.
Anschließend versetzen sie die Zellproben
mit einer Substanzbibliothek und testen,
wie die einzelnen Verbindungen der Stoffsammlung
den krankheitsbedingten Phänotyp
beeinflussen. Substanzen, die sich
positiv auswirken, kommen schließlich in
die engere Wahl und werden als mögliche
Leitstrukturen (Leads) weiter untersucht.
Auf welche(s) Zielmolekül(e) die potentiellen
Wirkstoffkandidaten einwirken und
wie der Wirkmechanismus konkret aussieht,
ist hierbei zunächst nebensächlich.
High-Content-Screens sind aber nicht
nur für Pharmaforscher interessant. Kombiniert
mit aktuellen molekularbiologischen
Techniken wie RNAi und CRISPR-Cas eröffnen
sie eine riesige Spielwiese für akademische
Forscher, die die Funktion ihres
Lieblings-Gens respektive -Proteins aufklären
wollen.
Kombiverfahren
Eines dieser Verfahren, das HCS und
CRISPR-Cas elegant miteinander verbindet,
nennt sich Array Library Screening. Bei diesem
kultiviert man die zu untersuchenden
Zellpopulationen in den getrennten Wells
einer Mikrotiterplatte. Die Zellen transfiziert
man dann mit Hilfe von Viren, Plasmiden
oder Oligos mit verschiedenen single
guide RNAs (sgRNAs). Will man gleichzeitig
die Wirkung einer Substanzbibliothek
auf die CRISP-Cas editierten Zellen testen,
gibt man diese ebenfalls hinzu.
Das HCS-Gerät erfasst die Phänotypen
der behandelten Zellen Well für Well und
ordnet sie den jeweiligen sgRNAs zu. Hat
es bei der Bildanalyse nichts übersehen,
erhält man so sämtliche sgRNAs, die den
gewünschten Phänotypen hervorrufen. Anschließend
muss man sich dann „nur noch“
die Zielgene dieser sgRNAs vorknöpfen.
Harald Zähringer
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