Auswirkungen skrotaler Hyperthermie auf quantitative und ...

Material und Methoden
Zusätzlich wurde von jeder Probe der Fremdpartikelgehalt bestimmt. Dazu wurden
885 μl destilliertes H2O, 5 μl PI und 10 μl Spermaprobe in ein Messröhrchen
pipettiert, gevortext, 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert und gemessen. Es
wurden dieselben Geräteeinstellungen verwendet wie für die oben beschriebenen
Messungen. Das destillierte H20 bewirkte, dass die Zellmembran für PI durchlässig
wurde, was zu einer Anfärbung der Kerne führte. Durch Addition von Q1 und Q2
erhielt man den prozentualen Gehalt nicht-DNA-haltiger Beimengungen im Ejakulat,
die bei der Messung mit erfasst wurden. Mittels folgender Formel wurde dann der
Anteil membranintakter Spermien (Q3) korrigiert (PETRUNKINA u. HARRISON,
persönl. Mitteilung).
Q3 korrigiert = Q3 unkorrigiert*100 _ Fremdpartikel *100
100 – Fremdpartikel 100 – Fremdpartikel
3.7.2 Spermienchromatinstruktur-Assay (SCSA TM )
Von jeder spermienreichen Phase wurden 2 x 300 μl entnommen, bei -196°C in
flüssigem Stickstoff tiefgefroren und bis zur Durchführung des SCSA TM gelagert. Die
Messung und Auswertung erfolgte am Ende des Versuches in willkürlicher
Reihenfolge binnen weniger Tage, um den subjektiven Einfluss und Variationen in
Bezug auf den Assay zu vermindern. Für die Messungen wurde das Gerät Epics XL-
MCL (Fa. Beckman Coulter, Krefeld) unter Einsatz eines FL-1-Filters für die
Grünfluoreszenz und eines FL-3-Filters für die Rotfluoreszenz verwendet. Die
Angaben von EVENSON und JOST (2000) bildeten die Grundlage für die
Probenaufbereitung und Messung. Sie wurden von STROTMANN (2009) für die
Tierart Hund modifiziert. Der gesamte Prozess erfolgte in Anlehnung an dieses
Protokoll.
Die tiefgefrorenen Proben wurden in einem Heizblock bei 37°C aufgetaut und dann
bei Raumtemperatur gelagert. Im Anschluss wurden die Proben mittels TNE-Puffer
auf ca. 2 x 10 6 Spermien / ml verdünnt. Es wurden 200 μl dieser Spermiensuspension
und 400 μl Säuredetergenz in ein Durchflusszytometerröhrchen
45