Auswirkungen skrotaler Hyperthermie auf quantitative und ...

Material und Methoden
verbracht und 30 Sekunden lang auf dem Vortexer gemischt. Die Färbung erfolgte
danach durch Zugabe von 1,2 ml Akridinorange (AO)-Färbelösung. Nach dreiminütiger
Inkubationszeit erfolgte die Messung. Es wurden Doppelproben angefertigt
und einzeln dem Färbeverfahren unterzogen. Die Ergebnisse beider Messungen
wurden gemittelt. Zur Sicherstellung konstanter Messbedingungen wurde zu Anfang
und nach jeder fünften Doppelprobe eine Kontrollprobe mit bekannten
Fluoreszenzintensitäten gemessen. Bei den Kontrollproben handelte es sich um
verdünntes Bullensperma eines Ejakulates.
Bei jeder Messung wurden 5000 Spermien computergestützt auf ihre
Fluoreszenzeigenschaft überprüft. Eine Grünfärbung der Spermien erfolgte bei
doppelsträngiger DNA, eine Rotfärbung bei einzelsträngiger DNA. Es wurde bei
jedem einzelnen Spermium der Anteil der Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz
(rot + grün) bestimmt und nach EVENSON und JOST (2000) als DFI (DNA-
Fragmentationsindex) bezeichnet. Abhängig von der Höhe der DFI-Werte der
einzelnen Spermien wurden sie in einem Punktwolkendiagramm FL-1 / FL-3
abgebildet (Abb. 5). In diesem konnte die Spermienpopulation von Debris und Zellen
mit übermäßig stark angefärbter DNA (high green Partikel) abgegrenzt werden. In
einer Verteilungskurve erfolgte subjektiv die Abgrenzung von Spermien mit niedrigem
DFI von Spermien mit erhöhtem DFI. Über ein Computerprogramm wurden zwei
Parameter ermittelt: zum einen der Anteil an Spermien mit hohem DNA-
Fragmentationsindex (%DFI) und zum anderen der mean DFI [Anteil der
Rotfluoreszenz an der Gesamtfluoreszenz (rot / (rot + grün) x 1000)].
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