Il Grifone in Italia WORKSHOP IL GRIFONE IN ITALIA - Acalandrostour

Il Grifone in Italia
Quaglia giapponese (Coturnix japonica) (Costantini et al., 2008b), da cellule ematiche della
rete vascolare embrionale della membrana testacea dell’uovo, dopo la schiusa. La metodica
genetica alternativa prevede l’associazione della PCR di base alla tecnica dell’analisi del
polimorfismo in lunghezza dei frammenti di restrizione (RFLP) con l’enzima HaeIII,
che riconosce un proprio sito bersaglio soltanto sul prodotto di amplificazione derivante
dal cromosoma sessuale Z, e l’enzima Asp700, che ha un sito di restrizione sul prodotto
di amplificazione del cromosoma sessuale W. I prodotti di PCR, dopo preliminare lettura
elettroforetica, vengono digeriti con un enzima per volta (HaeIII=5U; Asp700=2,5U) in
un volume finale di 20 µl contenenti 17,5 µl di prodotto di amplificazione. Dopo 3 ore di
incubazione, a 37°C, viene effettuata la lettura dei campioni, mediante elettroforesi su gel
di agarosio al 2%, colorazione con Etidio Bromuro e visualizzazione in luce UV. Con la
metodica PCR-RFLP la diagnosi di sesso risulta agevole in quanto, dopo separazione dei
digeriti su gel di agarosio vengono ottenuti nel caso dei soggetti di sesso femminile, con
entrambi gli enzimi tre bande con dimensioni comprese, nelle diverse specie, tra 370/400
paia di basi (bp) (banda grande), 310/340 bp (banda media) e 50/80 bp (banda piccola).
Nei soggetti di sesso maschile, invece, si ottengono due bande con dimensioni comprese tra
310/340 paia di basi (bp) (banda grande) e 50/80 bp (banda piccola) nelle specie sensibili
all’enzima HaeIII, ed una banda (370/400), nelle specie sensibili all’enzima Asp700 (Fig.2).
Fig.2 - PCR-RFLP (DNA) da piuma in
Pinguino di Humboldt (Spheniscushumboldti).
a, c: enzima HaeIII (2 bande = maschio; 3
bande = femmina). b, d: enzima Asp700 (1
banda = maschio; 3 bande = femmina). e:
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