Identifikation und funktionale Charakterisierung - Logo Dragon-Ivf ...

2.8 Verwendete Duftstoffe 38
2.8.1 Antagonisten 41
2.8.2 Duftstoffe aus Vaginal,-und Follikelflüssigkeit 41
3. Methoden 42
3.1 Kultivierung der HEK293-Zelllinie 42
3.1.1 Auftauen von HEK293 Zellen 43
3.1.2 Transiente Transfektion 43
3.2 Sertoli-Spermatogonien Kokultur 44
3.3 Transformation von Bakterien 45
3.3.1 Anzucht von Bakterien 45
3.3.2 Plasmidaufreinigung im präparativen Maßstab („Maxiprep“) 45
3.4 Isolierung und Aufarbeitung von Gesamt-RNA 46
3.4.1 Isolierung von RNA 47
3.4.2 Dnase Verdau 48
3.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 48
3.6 Agarosegelelektrophorese 50
3.7 Immunzytochemie 50
3.8 Percoll®-Dichtegradientenzentrifugation 52
3.9 Der Fluoreszenzfarbstoff fura-2 53
3.9.1 Fluoreszenzemmission von fura-2 54
3.9.2 Beladung von HEK293-Zellen mit fura-2/AM 55
3.9.3 Spermienaufbereitung für Ca 2+ -Imaging-Experimente 55
3.9.4 Das Ca 2+ -Imaging-System 56
3.10 Konfokale Mikroskopie 57
3.11 Die Patch Clamp Technik 58
3.11.1 Patch Clamp Konfiguration 58
3.11.2 Herstellung der Pipetten 59
3.11.3 Badelektrode und Patchelektrode 60
3.11.4 Patch Clamp Protokolle 61
3.11.5 Liquid-Junction Potential 62
3.11.6 Analyseparameter 63
4. Ergebnisse 64
4.1 Das rezeptive Feld von OR1D2 64
4.1.1 Messung der Silizium Analoga Bourgeonal und Lilial 66
4.1.2 Screening natürlicher Duftstoffe 68
4.1.2.1 Identifizierung der einzelnen Liganden 74
II