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Material & Methoden
wurde dann mit mindestens 30 µl RNase-freiem Wasser während einer 1 minütigen
Zentrifugation bei 10.000 rpm eluiert. Die Lösung wurde in einem RNase freiem 1,5 ml
Collection – Tube (Qiagen) aufgefangen und bei – 70 °C gelagert.
3.4.2 DNase Verdau
Zur Herstellung von cDNA wurde DNA -freie RNA benötigt. Dazu wurden die RNA Proben
mit DNase I verdaut. Pro 20 µl RNA wurden 1 µl DNase (1 U/µl) verwendet
und in einem Puffer mit mittlerer Salzkonzentration für 60 min bei 37 °C inkubiert.
3.5 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR)
Die Polymerase-Ketten-Reaktion stellt eine hochsensitive Methode dar, um einen kurzen
genau definierten Teil eines DNA-Strangs zu vervielfältigen (Mullis und Faloona, 1987). Die
PCR kann deshalb sowohl analytisch zum Nachweis von Sequenzen als auch präparativ zur
Synthese von DNA Fragmenten definierter Länge genutzt werden.
Der PCR Prozess besteht aus einer Serie von Zyklen, jeder Zyklus besteht aus drei
temperaturabhängigen Schritten.
Tabelle 2: Standardprotokoll für eine PCR
Schritt Temperatur Zeit
Denaturierung 94 °C 5 min
Annealing 55 °- 65 °C 1 min
Elongation 72 °C 1 min
Auffüllen 72 °C 10 min
Abkühlung 4 °C bis zur Entnahme der Probe
Zunächst wurde die Matrizen DNA auf 94 °C erhitzt, um die Stränge zu trennen
(Denaturierung). Dabei werden die Wasserstoffbrückenbindungen, die die beiden DNA
Stränge zusammenhalten, aufgebrochen.
Anschließend erfolgte durch die Erniedrigung der Temperatur, bei ca. 55 °C die Anlagerung
der Primer an die DNA Stränge (Annealing), wobei der eine Primer an den Sense-, und der
andere an den Antisense-Strang der Template DNA bindet. Die Annealingtemperatur richtet
sich nach der Schmelztemperatur der verwendeten Oligonukleotide, und lässt sich
näherungsweise mit folgender Formel berechnen:
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