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3.11 Die Patch Clamp Technik
Material & Methoden
Zur Messung von Strömen durch einzelne Ionenkanäle in der Membran von Spermatogonien
wurde die Patch Clamp Technik verwendet. Diese Technik wurde von Erwin Neher und Bert
Sakmann (1976) entwickelt und 1991 mit dem Nobelpreis für Medizin ausgezeichnet. Das
Besondere dieser Methode ist die Messung von nur wenigen Ionenkanälen auf einer extrem
kleinen Membranfläche (Patch), womit sogar Einzelkanalmessungen möglich sind. Der Strom
durch einzelne Kanalproteine liegt im Bereich von nur wenigen pA und geht somit leicht im
Rauschen unter. Die Entwicklung spezieller “patch-clamp“ Verstärker machte es möglich,
diese kleinen Ströme mit extrem hoher Zeitauflösung zu registrieren.
Um das Rauschen möglichst klein zu halten, muss der Patch elektrisch von seiner Umgebung
isoliert werden. Dafür sind Lipidmembranen besonders gut geeignet, da sie eine sehr dichte
Verbindung mit Glas eingehen. Um diesen hohen Abdichtwiderstand zu erreichen, wird die
Pipette auf die Zellmembran aufgesetzt und durch Anlegen eines Unterdrucks in der Pipette
wird die Membran etwas in die Pipette hineingezogen. Für den Abdichtwiderstand (Seal)
zwischen Pipette und Zellmembran sind mehrere Komponenten wie z.B. Wasserstoffbrücken
und Van der Waals Kräfte verantwortlich (Aldrich et al., 1983). Wenn der Widerstand
zwischen Pipette und Membran mehrere GigaOhm (GΩ) beträgt, spricht man von einem
„Gigaseal“.
3.11.1 Patch Clamp Konfigurationen
Nach Bildung des Gigaseals liegt bereits die On-cell Konfiguration, bzw. cell-attached
Konfiguration vor (s. Abb. A). In dieser Konfiguration kann das Membranstück der Zelle,
welches an der Pipettenspitze sitzt auf ein bestimmtes Potential „geklemmt“ werden.
Allerdings ist das Membranpotential am Patch nicht genau bestimmbar, da die Ladung der
intrazellulären Seite unbekannt ist und sich unter diesen Bedingungen nicht kontrollieren
lässt.
Wenn nun in der On-cell Konfiguration ein Pipettenunterdruck angelegt wird, kommt es zu
einem Aufbrechen des Membranfleckens und man spricht von der Whole-cell Konfiguration
(s. Abb. B). In der Whole-cell Konfiguration erhält die Pipette einen direkten Zugang zum
Zellinneren und es kommt zu einem Lösungsaustausch zwischen dem Zytosol der Zelle und
der Lösung in der Pipette. Hier ist es nun möglich die Zellmembran auf ein definiertes
Potential zu bringen und den Strom, der über die gesamte Zellmembran fließt, zu messen.
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