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Material & Methoden Zur Berechnung des Liquid-Junction Potentials wurde die Software „Junction Potential Calculator“ verwendet. Die Berechnung des Liquid-Junction Potentials ergab für die hier verwendeten Lösungen 4,1 mV (Pipettenlösung 1/Badlösung 1) und 4 mV (Pipettenlösung 2/Badlösung 1). Die Korrektur des Liquid-Junction Potentials erfolgte nicht während der Messungen, sondern wurde bei der Auswertung berücksichtigt. 3.11.6 Analyseparameter Die Analyse der Aktivierungs- und Inaktivierungskurven (Maximalstrom gegen Spannung) erfolgte mit der Software „Fitmaster“ durch Nutzer definierte Cursoreinstellungen. 63
4. Ergebnisse 4.1 Das rezeptive Feld von OR1D2 Ergebnisse Spehr et al. gelang es 2003 am Lehrstuhl für Zellphysiologie der Ruhr-Universität Bochum einen von Spermien exprimierten Geruchsrezeptor (OR1D2) zu identifizieren. In derselben Arbeit wurde mittels rekombinanter Expression dieses Rezeptors in menschlichen Nierentumorzellen (HEK293-Zellen) ein OR1D2-spezifischen Ligand gefunden (Bourgeonal). Dieser Ligand wirkt auf humane Spermien chemotaktisch und chemokinetisch. Ein Ziel der vorliegenden Arbeit war es, das 2003 beschriebene molekulare rezeptive Feld von OR1D2 signifikant zu erweitern, um neue Informationen über die Struktur der Ligandenbindetasche dieses ektopisch auf humanen Spermien expremierten Rezeptors zu erhalten. Aufgrund der technischen Schwierigkeiten bei der kristallographischen Strukturanalyse von Membranproteinen, sind die genauen Wechselwirkungen zwischen einem olfaktorischen Rezeptor und einem aktivierenden Geruchsmolekül bis heute weitgehend unbekannt. Generell basieren die meisten Rezeptor-Liganden Modelle auf einem „Schlüssel- Schloss“ Prinzip (sterische Theorie), das eine räumliche Wechselwirkung zwischen den Aminosäureseitenketten einer Ligandenbinderegion und einem strukturell „passenden“ Molekül beschreibt. Eine andere Theorie, die sog. Vibrationstheorie, wurde 1996 von Luca Turin entwickelt (Turin, 1996: A spectroscopic mechanism for primary olfactory reception. Chem. Senses). Danach detektieren Geruchsrezeptoren Duftstoffe anhand intrinsischer Molekülvibrationen. Die theoretischen Erwägungen von Turin fanden ein erstaunliches Medienecho, obwohl die Vibrationstheorie bis dato nie experimentellen Tests unterzogen wurde. Durch Struktur-Funktionsanalysen an rekombinant exprimierten Riechrezeptoren lassen sich experimentell grundlegende Erkenntnisse über die Mechanistik olfaktorischer Rezeptor- Liganden-Interaktion gewinnen. OR1D2 wurde für die in der vorliegenden Arbeit beschriebenen Versuche ausgewählt, da dieser Rezeptor sowohl in olfaktorischen sensorischen Neuronen, als auch in menschlichen Spermien identifiziert wurde und einer der wenigen olfaktorischen Rezeptoren ist, für den ein molekulares rezeptives Feld bekannt ist. Bourgeonal ist bis jetzt der potenteste identifizierte Agonist für OR1D2. Daher wurden für die Struktur-Funktionsanalysen Duftstoffe ausgewählt, die entweder aufgrund ihres psychophysischen Wahrnehmungsprofils oder ihrer chemischen Struktur Ähnlichkeiten mit Bourgeonal aufweisen (Triller et al., 2008). 64
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Identifikation und funktionale Char
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Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1
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4.2 Elektrophysiologische Charakter
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Einleitung der die Duftmoleküle l
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Einleitung Abb.1.2: Modell der Seku
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Einleitung Die Frage, ob jedes Sper
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Einleitung Abb. 1.3: Schematische D
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Einleitung besitzt vier Ca 2+ -Bind
Seite 17 und 18: Abb. 1.4: Spermienentwicklung. Darg
Seite 19 und 20: 1.8 Exkurs: Der weibliche Zyklus Ei
Seite 21 und 22: Einleitung In Spermien ist der Kana
Seite 23 und 24: Einleitung Kv3.4, Kv4.1, Kv4.2 und
Seite 25 und 26: 1.10 Exkurs-TRP-Kanäle Einleitung
Seite 27 und 28: Einleitung - Die TRPML Familie - Di
Seite 29 und 30: Einleitung Ein wichtiges Ziel diese
Seite 31 und 32: Trypsin/EDTA Gibco BRL Tween-20 Sol
Seite 33 und 34: Material & Methoden Pipetten Pipetm
Seite 35 und 36: Lyse-Puffer 10 mM Tris-HCl; pH 7,9
Seite 37 und 38: Material & Methoden 10 ng/ml EGF (S
Seite 39 und 40: Standard TEA Extra 130 mM NaCl pH =
Seite 41 und 42: 2.5 Bakterienstämme Material & Met
Seite 43 und 44: 2.8 Verwendete Duftstoffe Bourgeona
Seite 45 und 46: 14610 22083 22650 23827 24576 24801
Seite 47 und 48: 3. Methoden - Zellkultur - Furaneol
Seite 49 und 50: Material & Methoden Der 1 ml Transf
Seite 51 und 52: - DNA Fällung - Material & Methode
Seite 53 und 54: Material & Methoden wurde dann mit
Seite 55 und 56: 3.6 Agarosegelelektrophorese Materi
Seite 57 und 58: Material & Methoden einem letzten S
Seite 59 und 60: 3.9.1 Fluoreszenzemmission von fura
Seite 61 und 62: 3.9.4 Das Ca 2+ -Imaging-System Mat
Seite 63 und 64: 3.11 Die Patch Clamp Technik Materi
Seite 65 und 66: 3.11.3 Badelektrode und Patchelektr
Seite 67: Material & Methoden Zur Untersuchun
Seite 71 und 72: Ergebnisse Abbildung 4.1 A zeigt be
Seite 73 und 74: Ergebnisse (s. Abb. 4.2 C). Dabei l
Seite 75 und 76: Ergebnisse Abb. 4.3: Messung der Ca
Seite 79 und 80: Ergebnisse Zur Untersuchung einzeln
Seite 83 und 84: Ergebnisse Abb. 4.12: Messung der C
Seite 85 und 86: Ergebnisse (s. Pfeilspitze, Abb. 4.
Seite 87 und 88: 4.2.1 Passive Membraneigenschaften
Seite 89 und 90: Ergebnisse Abb. 4.17: „Steady-sta
Seite 91 und 92: Ergebnisse einen ‚delayed rectifi
Seite 93 und 94: Ergebnisse Abb. 4.20: Messung von K
Seite 95 und 96: Ergebnisse Um die Existenz eines T-
Seite 97 und 98: Ergebnisse Abb. 4.23: CaV3.2 Protei
Seite 99 und 100: Ergebnisse Abb. 4.25: Spermatogonie
Seite 101 und 102: Ergebnisse Beide Arten von Ca 2+ v-
Seite 103 und 104: Ergebnisse Abb. 4.28: Der Effekt vo
Seite 105 und 106: Ergebnisse Abb. 4.29.: Spermatogoni
Seite 107 und 108: Ergebnisse Abb. 4.31: Kontrollexper
Seite 109 und 110: Ergebnisse diesem Grund wurden Expe
Seite 111 und 112: Abb. 4.34: RT-PCR mit spezifischen
Seite 113 und 114: Diskussion Rezeptors zu erhalten. B
Seite 115 und 116: 5.2 Screening natürlicher Duftstof
Seite 117 und 118: 5.3.1 Untersuchung von spannungsabh
Seite 119 und 120:
Diskussion hauptsächlich Cholester
Seite 121 und 122:
Diskussion bewirkten. Dieser Befund
Seite 123 und 124:
Diskussion TRPM8-Kanal, sowie in de
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Diskussion sensorischen Neuronen ko
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6. Zusammenfassung Zusammenfassung
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Zusammenfassung recombinant OR expr
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E. coli Escherischa coli Abkürzung
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O.D. Optische Dichte Abkürzungen O
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8. Literatur Literatur Abbracchio M
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Literatur Bourinet E., Soong TW., S
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Literatur Cross NL., Mahareshti P.
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Literatur Florman HM., Corron ME.,
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Literatur Hagiwara S., Ozawa S., Sa
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Literatur Kanold PO., Manis PB. (19
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Literatur Mezler M., Fleischer J.,
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Literatur Peier AM., Moqrich A., He
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Literatur Roeper J., Pongs O. (1996
Seite 153 und 154:
Literatur Spehr M., Schwane K., Hei
Seite 155 und 156:
Literatur Trevino CL., Serrano CJ.,
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Literatur Wetzel CH., Oles M., Well
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Literatur Zufall F. (1993) Cyclic A
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10.Anhang 10.1 Lebenslauf Persönli
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10.2 Publikationen Publizierte Arti
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11. Erklärung Erklärung Hiermit e
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