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Material & Methoden
Abb. 3.2 A: Lage der Hoden im Körper Abb. 3.2 B: Präparierter linker Hoden, Abb. 3.2 C: Präparierter
rechter Hoden.
3.3 Transformation von Bakterien
Zur Transformation wurden 30 µl kompetente Bakterien (XL1 Blue) mit 1 µl rekombinanter
Plasmid-DNA vermischt und 15 min auf Eis inkubiert. Nach anschließendem Hitzeschock (90
s, 42 °C) wurde der Ansatz auf LB-Agarplatten, die zur Selektion auf rekombinante Bakterien
entsprechende Antibiotika enthielten, ausplattiert und über Nacht bei 37 °C inkubiert.
3.3.1 Anzucht von Bakterien
Die Anzucht einer Bakterienkultur erfolgte in 200 ml LB-Medium mit der entsprechenden
Antibiotikaresistenz (100 mg/ml Ampicillin).
Dazu wurde eine Kolonie in das oben genannte Medium überimpft und bei 37 °C und 250
rpm über Nacht im Warmluftschüttler bebrütet.
3.3.2 Plasmidaufreinigung im präparativen Maßstab („Maxiprep“)
Zur Isolation von hochreiner Plasmid-DNA im präparativen Maßstab wurde das Plasmid-
Isolations-Kit der Firma Qiagen verwendet (Qiagen Plamid Maxi Kit). Die Lyse der Bakterien
erfolgt durch alkalischen Aufschluss (Birnboim und Doly, 1979) und die Reinigung der
Plasmid-DNA über Anionenaustauscher, die die spezifische DNA binden.
Durch Waschschritte bei mittlerer Salzkonzentration wurden RNA, Proteine, Farbstoffe und
niedermolekulare Verunreinigungen entfernt. Anschließend konnte die Plasmid-DNA mit
A.dest eluiert werden.
Es wurden je nach zu isolierender Plasmidmenge entsprechende Volumina Bakterienkultur
herangezogen, die dann gemäß den Herstellerangaben aufgearbeitet wurden.
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