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Material & Methoden
unspezifische Bindungsstellen zu blockieren. Nach Entfernung der Blocklösung wurde der
Primärantikörper aufgetragen (1:200 Verdünnung in Blocklösung, DAZL, oder Anti-Cav3.2)
und die Zellen für 1 h bei RT inkubiert. Danach wurde der Primärantikörper durch
dreimaliges Waschen (2 x 10 min, 1 x 20 min) mit Blocklösung entfernt, worauf die
Inkubation mit dem jeweils passenden Sekundärantikörper (1:200 Verdünnung, goat anti
rabbit 488, 532 oder 633) für 45 min bei RT erfolgte. Da ein Fluophor-gekoppelter
Sekundärantikörper verwendet wurde, geschah dies in Dunkelheit. Auch der
Sekundärantikörper wurde durch drei Waschschritte (2 x 10 min, 1 x 20 min) mit der
Blocklösung entfernt. Danach wurden 2 ml PBS -- auf die Zellen gegeben und die Kulturen
unter dem Fluoreszenzmikroskop untersucht.
Falls Zellkerne mit dem DNA Farbstoff DAPI (1:100) gefärbt wurden, erfolgte diese nach
dem letzten Waschschritt und zwar für 15 min bei RT, danach wurde erneut gewaschen.
Zur Kontrolle, ob eine unspezifische Färbung durch den Sekundärantikörper erfolgte, wurden
bei Kontrollkulturen anstelle des Primärantikörpers die Blocklösung aufgetragen und dann
mit dem Sekundärantikörper inkubiert. Die Fluoreszenzintensität wurde dann zwischen
Kontrollkulturen und den Kulturen mit der spezifischen Färbung verglichen.
-Doppelfärbungen mit Antikörpern aus dem gleichen Tier-
Doppelfärbungen mit Primärantikörpern, die in der gleichen Tierart (Kaninchen) gewonnen
wurden, wurden bis zur Inkubation mit den Primärantikörpern ebenso durchgeführt wie oben
beschrieben. Dann wurde allerdings der 1. Primärantikörper über Nacht bei 4 °C inkubiert.
Am nächsten Tag erfolgte ebenfalls ein dreimaliges Waschen (2 x 10 min, 1 x 20 min) mit der
Blocklösung und die Inkubation mit dem passenden Sekundärantikörper. Zur Entfernung des
Sekundärantikörpers wurde viermal mit Blocklösung gewaschen (3 x 10 min, 1 x 30 min).
Danach wurden die Kulturen für 1 h in Blocklösung mit 2 % Kaninchen Serum (1:50
Verdünnung) bei RT inkubiert. Es folgte ein viermaliges Waschen mit der Blocklösung (3 x
10 min, 1 x 30 min). Nach dem Waschen wurden die Zellen für 1 h in Blocklösung mit
affiniPure Fab fragments gαr IgG (1:50 Verdünnung) inkubiert. Es folgten vier weitere
Waschschritte und die Inkubation des 2. Primärantikörpers über Nacht bei 4 °C. Reste des 2.
Primärantikörpers wurden mit vier Waschritten (3 x 10 min, 1 x 30 min) entfernt und danach
wurden die Zellen wiederum für 1 h bei RT mit dem 2. Sekundärantikörper inkubiert. In
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