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Material & Methoden
Der 1 ml Transfektionsansatz (für 5 Kulturschalen) enthielt 410 µl H2O versetzt mit 40 µl der
jeweiligen Plasmid DNA (1 µg/µl), sowie 50 µl einer 2,5 M CaCl2 Lösung. Tropfenweise
wurde 500 µl 2 x HBS hinzugegeben und durch 5 Luftblasen, die mit Hilfe einer 1000 µl
Pipette gebildet wurden, vorsichtig gemischt. Nach einer 15 minütigen Inkubation bei RT
wurde der Ansatz in das Medium der Kulturschale geträufelt und die Zellen in den CO2-
Inkubator zurückgestellt. Ungefähr 24 h später (Übernacht-Transfektion) wurde das Präzipitat
durch einen Mediumwechsel entfernt und die Zellen abermals für 24 h in DMEM Medium bei
37 °C und 5 % CO2 inkubiert.
Tabelle1: Transfektionsansatz für die Transfektion von HEK 293 Zellen
Substanz /
Konzentration
H20
DNA
(1 µg/µl)
CaCl2
(2,5 M)
2x HBS
Volumen (µl) 410 40 50 500
3.2 Sertoli-Spermatogonien Kokultur
Zur Herstellung der Sertoli-Spermatogonien Kokultur wurden beide Hoden männlicher
C57/Bl6 Mäuse direkt nach Dekapitierung am postnatalen Tag 7 präpariert (s. Abb….) und in
2 ml MEM Medium gesammelt. Nach Entfernung der Tunica albuginea wurden die Tubuli
seminiferi in 1 ml MEM gesammelt, vorsichtig mit einer Pinzette auseinandergezupft und in
ein 15 ml Plastikröhrchen mit 1 ml Collagenase (2 mg/ml in PBS -- ) überführt und für 5 min
bei 37 °C im Wasserbad verdaut. Um den Verdau zu stoppen, wurden 3 ml
Spermatogonienmedium zu den Zellen hinzugegeben. Danach wurde die Zellsuspension für 8
min bei 390 g abzentrifugiert. Nach Abnahme des Überstandes wurde das Zellpellet
vorsichtig in 2 ml Trypsin/EDTA resuspendiert und erneut für 5 min verdaut. Zum Abstoppen
wurden wiederum 3 ml Spermatogonienmedium zu den Zellen hinzugegeben und diese
wurden ein weiteres Mal für 10 min bei 390 g abzentrifugiert.
Das Zellpellet wurde dann in 8 ml Spermatogonienmedium (für 8 Schälchen) resuspendiert
und in Falcon Schälchen auf einem Glasdeckgläschen ausgesät. Die Kultivierung der Zellen
erfolgte die ersten 3 Tage im Brutschrank bei 37 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit und die
darauf folgende Zeit bei 35 °C, 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit. Am ersten Tag in Kultur
wurde 1 ml Medium hinzugegeben und an jedem weiteren Tag wurde die Hälfte des Mediums
entfernt und durch frisches ersetzt.
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