Identifikation und funktionale Charakterisierung - Logo Dragon-Ivf ...

3.9.2 Beladung von HEK 293 Zellen mit fura-2/AM
Material & Methoden
Zur Messung der intrazellulären Konzentration freier Ca 2+ -Ionen wurden Kulturen zwei Tage
nach der Transfektion verwendet. Die Beladung der Zellen erfolgte mit dem
Fluoreszenzfarbstoff fura-2/AM. Dabei handelt es sich um einen lipophilen,
membranpermeablen Acetoxymethylester. Der Farbstoff kann in dieser Form durch die
Membran in alle Zellkompartimente diffundieren. Im Zytosol werden dann die
Esterbindungen durch endogene, unspezifische Esterasen aufgespalten und somit der
membranundurchlässige Ca 2+ -sensitive fura-2 Farbstoff hydrolisiert.
Das Beladen der Zellen erfolgte durch eine 30 minütige Inkubation in 1 ml Ringer mit 3 µM
fura-2/AM unter Lichtausschluss. Bei längerer Inkubationszeit werden die Zellen mit dem
Farbstoff überladen. Diese Überladung ist zu vermeiden, da bei sehr hohen fura-2
Konzentrationen überproportional viele fura-2 Moleküle im Ca 2+ -freien Zustand vorliegen.
Überwiegt der Anteil der Ca 2+ -freien fura-2 Moleküle auch während einer Erhöhung der
intrazellulären Ca 2+ -Konzentration, so kann die resultierende Fluoreszenzänderung weniger
fura-2 Moleküle nicht detektiert werden.
Um das überschüssige Fura-2/AM zu entfernen, wurde die farbstoffhaltige Lösung nach der
Inkubationszeit durch 1 ml Ringerlösung ersetzt.
3.9.3 Spermienaufbereitung für Ca 2+ - Imaging-Experimente
Die Spermienaufbereitung erfolgte wie oben beschrieben. Nach der letzten Zentrifugation
wurde die OD bestimmt um die richtige Zellkonzentration für das Kalzium Imaging zu
erhalten, diese sollte bei einer Wellenlänge von 260 nm zwischen 0,035 und 0,04 nm liegen.
Zur Beladung der Spermien wurden in 1 ml Spermien-Ringerlösung 7,5 µl Fura (7,5 µM)
gegeben. Danach wurden jeweils 2 ml der beladenen Spermienringerlösung auf ein mit Con A
beschichtetes Glasdeckgläschen in einem Falconschälchen gegeben. Aufgrund der
Beschichtung bleiben die Spermien auf diesem Deckglas haften und erlauben so Experimente
ohne starke Bewegungen der Zellen. Nach einer Beladungszeit von 45 min wurde die
Spermienringerlösung durch 2 ml vorgewärmter Ringerlösung ersetzt.
55