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3.6 Agarosegelelektrophorese
Material & Methoden
Die Agarosegelelektrophorese ist eine Methode, um DNA Stränge nach ihrer Größe
aufzutrennen. Dazu wird ein elektrisches Feld verwendet, um die negativ geladenen DNA
Moleküle durch das Gel zu ziehen, wobei sich ein kleineres DNA Molekül schneller durch
das Gel bewegt, als ein größeres. Um die Stränge der unbekannten DNA-Moleküle
bestimmen zu können, wurden Standard DNA Fragmente (Gibco) verwendet.
Die Agarosegelkonzentration wurde entsprechend der Größe der aufzutrennenden Fragmente
bestimmt, wenn nicht anders angegeben, wurden 1 % Gele verwendet.
Der gewünschte Anteil an Agarose wurde in 1 x TBE Puffer aufgekocht, mit Ethidiumbromid
(0,4 µg/ml) versetzt und in die Gelkammer gegossen, wobei ein Plexiglaskamm in das Gel
hineingesteckt wird, um die Probentaschen auszusparen. Nach Erstarren des Gels wird 1 x
TBE Puffer als Laufpuffer über das Gel gegossen und der Kamm entfernt. Die
aufzutrennenden Proben wurden mit 1/5 Volumen DNA Probenpuffer versetzt und
anschließend in die Geltaschen aufgetragen. Die DNA Fragmente wurden elektrophoretisch
mit einer konstanten Spannung von 5 V/cm getrennt. Das Gel wird dann unter einer UV
Lampe (312 nm) betrachtet, da das Ethidiumbromid, das sich in die DNA eingelagert hat, im
ultravioletten Licht fluoresziert und mit einer CCD Kamera fotografiert.
3.7 Immunzytochemie
Grundlage der Immunzytochemie oder Antikörperfärbung ist eine Antigen-Antikörper
Reaktion. Dabei erfolgt ein Nachweis von spezifischen Proteinen in Geweben, da es zu einer
Bindung zwischen einem Primärantikörper und dem entsprechendem zell- und
gewebespezifischen Antigen kommt. In einem zweiten Schritt wird ein Sekundärantikörper
aufgetragen. Dieser bindet spezifisch den Primärantikörper und ist entweder an einen
fluoreszierenden Farbstoff gekoppelt oder löst eine Enzym-Substrat-Reaktion aus.
-Färbungen mit einem Antikörper-
Für den immunzytochemischen Nachweis von Proteinen in Sertoli Spermatogonien Kulturen
wurden diese zuerst kurz mit PBS -- gewaschen und dann in 4 % PFA (gelöst in PBS -- ) 45 min
bei RT fixiert. Nach zweimaligem Waschen mit einer Blocklösung (1 % BSA und 0,01 %
Triton in PBS -- ) wurden die Kulturen für 1 h mit derselben Blocklösung inkubiert, um
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