Identifikation und funktionale Charakterisierung - Logo Dragon-Ivf ...

- DNA Fällung -
Material & Methoden
Die anschließende Natriumacetat-Fällung dient der gleichzeitigen Konzentration und
Entsalzung der DNA.
Dazu wurde die gelöste DNA mit 1/10 Vol. Natriumacetat und 21/2 fachen Volumen 100 %
Ethanol vermischt und für 20 min auf Eis inkubiert. Nach einer 10 minütigen Zentrifugation
mit 14000 rpm bei Raumtemperatur (RT) wurde der Überstand verworfen und das DNA
Pellet mit 70 % Ethanol gewaschen. Der Ansatz wurde kurz geschwenkt und nochmals für 5
min bei 14000 rpm (RT) zentrifugiert. Vorsichtig wurde der komplette Überstand
abgenommen, um das Pellet gründlich trocknen zu lassen. Anschließend wurde das Pellet in
einer entsprechenden Menge A. dest aufgenommen.
- Quantifizierung der DNA und RNA -
Die Bestimmung der DNA und RNA Konzentration erfolgte durch photometrische
Messungen (Sambrook et al., 1989). Mit der gemessenen Extinktion (optische Dichte, OD)
bei einer Wellenlänge von 260 nm wurde der Gehalt mittels folgender Formel berechnet:
DNA-Konzentration [µg / µl] = OD260 x Verdünnungsfaktor x 0,05
RNA-Konzentration [µg / µl] = OD260 x Verdünnungsfaktor x 0,04
3.4 Isolierung und Aufarbeitung von Gesamt – RNA
Zur Minimierung von Kontaminationen durch Ribonukleasen und der damit verbundenen
Gefahr der Degradation der RNA wurden alle Geräte mit 3 % H2O2 gereinigt und
ausschließlich RNase freie Lösungen verwendet. Ferner wurden Handschuhe getragen, um die
Übertragung der RNasen von der Haut auf die Probe zu vermeiden.
Die Isolierung von Gesamt-RNA aus menschlichem Testesgewebe erfolgte nach der TRIzol
Methode (Total RNA Isolation Reagent), die eine Modifizierung der von Chomczynski u.
Sacchi (1987) entwickelten Methode darstellt.
TRIzol ist eine monophasische Lösung aus Phenol und Guanidinisothiocyanat, die während
der Homogenisierung von Gewebe die Zellen und ihre Bestandteile zerstört, während die
RNA nicht beeinträchtigt wird.
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