HerzSupplement - Pentalong von Actavis

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Herz Supplement Cardiovascular Diseases Institut für Pharmakologie, Uniklinik Köln, Köln, Deutschland 50 Vergleichende Untersuchung der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies durch organische Nitrate mit dem Indikator Dihydrorhodamin 123 Tim Bauer und Renate Rösen Zusammenfassung: Die potente und rasche antianginöse Wirkung der organischen Nitrate macht diese zur wichtigsten Substanzklasse zur Kupierung des akuten AnginapectorisAnfalls. Die Langzeittherapie wird allerdings durch eine schnell eintretende Toleranzentwicklung gegenüber dieser Gruppe von Vasodilatatoren limitiert. Der Zusammenhang zwischen der Toleranzentwicklung und der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies, die u. a. in der Lage sind, das metabolisierende Enzym, die mitochondriale Aldehyddehydrogenase (ALDH2), zu inhibieren, gilt heute als gesichert. Um Ursachen für die unterschiedlich ausgeprägte Toleranzentwicklung gegenüber verschiedenen organischen Nitraten zu untersuchen, haben wir deren Einfluss auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspe zies (ROS) in humanen Endothelzellen (EA.hy.926) und isolierten Mitochondrien mit dem Indikator Dihydrorhodamin 123 (DHR123) untersucht. Dieser wird zum fluoreszierenden Rhodamin 123 (R123) oxidiert, welches intrazellulär akkumuliert. Im Fall der Inkubation humaner Endothelzellen mit Glyceroltrinitrat (GTN) wurde mittels Fluoreszenzfotografie mit steigender Inkubationszeit allerdings eine Abnahme der intrazellulären Rhodaminfluoreszenz beobacht, sodass R123 in folgenden Experimenten intra und extrazellulär quantifiziert werden musste, um die ge Die organischen Nitrate sind bereits seit über 150 Jahren Bestandteil der symptomatischen Therapie von Koronarerkrankungen. Es handelt sich bei diesen Substanzen, deren wohl bekanntester Vertreter Glyceroltrinitrat (GTN) ist, um Ester der Salpetersäure, aus denen reduktiv NO abgespalten wird. Die durch NO induzierte samte Stoffmenge des gebildeten Rhodamins zu erfassen. Das bedeutet, dass bei der Verwendung von DHR123 als Indikator für ROS ein verändertes Fluoreszenzsignal nicht ausschließlich auf eine Verschiebung des intrazellulären Redoxgleichgewichts zurückgeführt werden kann, sondern auch Prozesse wie aktiver Transport oder die Öffnung der Transitionsporen der Mitochondrien eine Rolle spielen können. Mit DHR123 als Indikator konnte gezeigt werden, dass Isosorbitdinitrat, Glyceroltrinitrat und Pentaerithrityltetranitrat die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies in EA.hy.926 und isolierten Mitochondrien in unterschiedlichem Ausmaß beeinflussen. Da die Inhibition der ALDH2 mit Benomyl bzw. Chloralhydrat sowie die Inkubation isolierter Mitochondrien mit einem Aldehyd ebenfalls zu einer gesteigerten Bildung reaktiver Sauerstoffspezies führte, kann die nach GTNInkubation beobachtete starke ROSBildung durch dessen inhibitorischen Effekt auf die ALDH2Aktivität erklärt werden, sodass die Entstehung reaktiver Sauerstoffspezies in direktem Zusammenhang mit der ALDH2Aktivität zu stehen scheint. Schlüsselwörter: Organische Nitrate – reaktive Sauerstoffspezies – Dihydrorhodamin 123 – mitochondriale Aldehyddehydroge nase Signalkaskade resultiert in einer Dilatation der glatten Muskulatur und somit der Gefäße. Besonders über die so erreichte Vorlastsenkung wird der Sauerstoffbedarf am Herzen vermindert. Der den Wirkungsmechanismus betreffenden Homologie stehen allerdings verschiedene heterologe Eigenschaften dieser Substanzklasse gegenüber: Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
Klinisch von Bedeutung sind vor allem eine sich rasch entwickelnde Tachyphylaxie, die die Anwendung der organischen Nitrate in der Dauertherapie limitiert und in Verbindung damit die Verschiebung des Redoxgleichgewichts, d.h. die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies. Erste Hinweise auf einen Zusammenhang zwischen der Bildung reaktiver Sauerstoffspezies und der Toleranzentstehung wurden 1995 von Münzel und Kollegen veröffentlicht [1]. Heute gibt es zahlreiche Publikationen, die das Modell des oxidativen Stresses in Bezug auf die Toleranzentstehung stützen [2, 3]. In den vergangenen Jahrzehnten wurden verschiedene – nicht enzymatische und enzymatische – Wege zur Bioaktivierung der organischen Nitrate diskutiert, aber nachdem 2002 Chen et al. die mitochondriale Aldehyddehydrogenase (ALDH2) als Glyceroltrinitrat (GTN) metabolisierendes Enzym identifizierten, gibt es mehrere Publikationen, die einen klaren Zusammenhang zwischen dem Metabolismus der organischen Nitrate und diesem Enzym aufzeigen [4]. Die ALDH2 weist im katalytischen Zentrum Cysteinreste auf, die in vitro nach Exposition isolierter Mitochondrien mit verschiedenen reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) oxidiert werden konnten, was in einer Inaktivierung der ALDH2 resultierte [5]. Basierend auf diesen Erkenntnissen findet sich ein Erklärungsansatz für die Entstehung der mechanismusbasierten Toleranz, sodass wir GTN als Leitsubstanz der organischen Nitrate im Vergleich zu Pentaerithrityltetranitrat (PETN) sowie Isosorbitdinitrat (ISDN) bezüglich ihrer Wirkung auf die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies nach Inkubation von u.a. humanen Endothelzellen sowie isolierten Mitochondrien getestet haben. Als Indikator für den Nachweis reaktiver Sauerstoffspezies wurde dazu Dihydrorhodamin 123 (DHR123) verwendet, das im ungeladenen Zustand über die Zellmembran diffundiert und in der Zelle mit reaktiven Sauerstoffspezies zum fluoreszierenden Rhodamin 123 (Rh123) abreagiert [6]. Die positive Ladung sowie die Akkumulation von Rhodamin in Mitochondrien [7] lassen erwarten, dass Rh123 intrazellulär verbleibt. Der Literatur zufolge bleibt das Signal eine Stunde stabil. Eine Abnahme der Fluoreszenz, die auf diffusionskontrollierte Prozesse zurückzuführen ist, sollte in einem zeitlichen Rahmen Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel ablaufen, der größer ist als die von uns gewählten Inkubationszeiten [6]. Ergebnisse und Diskussion Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies nach GTNInkubation wurde bereits in verschiedenen Geweben nachgewiesen [8–11]. Daher haben wir zunächst untersucht, ob dieser Effekt auch auf die humane Endothelzelllinie EA.hy.926 übertragbar ist. Diese Zellen wurden gewählt, da das Endothel eine bedeutende Rolle bei der pathophysiologischen Bildung reaktiver Sauerstoffspezies spielt [1, 12]. Die Quantifizierung der intrazellulären Fluoreszenz erfolgte dabei zunächst an Hand von Fluoreszenzfärbungen und Mikroskopiebildern [13, 14]. Abbildung 1A zeigt, dass nach GTNInkubation der EA.hy.926Zellen die erwartete Zunahme der detektierten Fluoreszenz im Vergleich zu unbehandelten Zellen beobachtet wer 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 –20 –40 140 120 100 80 60 40 20 0 50 µM 5 10 Zeit [Minuten] Organische Nitrate Abb. 1: Determination reaktiver Sauerstoffspezies mittels Fluoreszenzmikroskopie. Dargestellt ist die relative Änderung der 123-Rhodaminfluoreszenz in EA. hy.926 Zellen in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer nach Stimulation mit 50 und 500 μmol/l GTN (A) sowie nach 60 min Inkubation mit 2 μmol/l Cyclosporin A bzw. 500 μmol/l GTN allein oder zusammen (B). Dargestellt sind die Δ%-Werte bezogen auf unstimulierte Zellen (*: signifikant gegenüber unstimulierten Zellen). a B 132-Rhodaminfluoreszenz ∆% zu unstimulierten Zellen 132-Rhodaminfluoreszenz ∆% zu unstimulierten Zellen * * Cyclo A * 500 µM 20 5 10 20 * GTN * * * # * Cyclo A + GTN 51
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