HerzSupplement - Pentalong von Actavis

Klinisch von Bedeutung sind vor allem eine
sich rasch entwickelnde Tachyphylaxie, die
die Anwendung der organischen Nitrate in
der Dauertherapie limitiert und in Verbindung
damit die Verschiebung des Redoxgleichgewichts,
d.h. die Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies. Erste Hinweise auf einen
Zusammenhang zwischen der Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies und der Toleranzentstehung
wurden 1995 von Münzel
und Kollegen veröffentlicht [1]. Heute gibt
es zahlreiche Publikationen, die das Modell
des oxidativen Stresses in Bezug auf die Toleranzentstehung
stützen [2, 3].
In den vergangenen Jahrzehnten wurden
verschiedene – nicht enzymatische und
enzymatische – Wege zur Bioaktivierung
der organischen Nitrate diskutiert, aber
nachdem 2002 Chen et al. die mitochondriale
Aldehyddehydrogenase (ALDH­2)
als Glyceroltrinitrat (GTN) metabolisierendes
Enzym identifizierten, gibt es mehrere
Publikationen, die einen klaren Zusammenhang
zwischen dem Metabolismus
der organischen Nitrate und diesem Enzym
aufzeigen [4]. Die ALDH­2 weist im katalytischen
Zentrum Cysteinreste auf, die in
vitro nach Exposition isolierter Mitochondrien
mit verschiedenen reaktiven Sauerstoffspezies
(ROS) oxidiert werden konnten,
was in einer Inaktivierung der ALDH­2
resultierte [5]. Basierend auf diesen Erkenntnissen
findet sich ein Erklärungsansatz
für die Entstehung der mechanismusbasierten
Toleranz, sodass wir GTN als
Leitsubstanz der organischen Nitrate im
Vergleich zu Pentaerithrityltetranitrat
(PETN) sowie Isosorbitdinitrat (ISDN) bezüglich
ihrer Wirkung auf die Bildung reaktiver
Sauerstoffspezies nach Inkubation
von u.a. humanen Endothelzellen sowie
isolierten Mitochondrien getestet haben.
Als Indikator für den Nachweis reaktiver
Sauerstoffspezies wurde dazu Dihydrorhodamin
123 (DHR123) verwendet,
das im ungeladenen Zustand über die Zellmembran
diffundiert und in der Zelle mit
reaktiven Sauerstoffspezies zum fluoreszierenden
Rhodamin 123 (Rh123) abreagiert
[6]. Die positive Ladung sowie die
Akkumulation von Rhodamin in Mitochondrien
[7] lassen erwarten, dass Rh123
intrazellulär verbleibt. Der Literatur zufolge
bleibt das Signal eine Stunde stabil. Eine
Abnahme der Fluoreszenz, die auf diffusionskontrollierte
Prozesse zurückzuführen
ist, sollte in einem zeitlichen Rahmen
Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel
ablaufen, der größer ist als die von uns gewählten
Inkubationszeiten [6].
Ergebnisse und Diskussion
Die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
nach GTN­Inkubation wurde bereits in verschiedenen
Geweben nachgewiesen [8–11].
Daher haben wir zunächst untersucht, ob
dieser Effekt auch auf die humane Endothelzelllinie
EA.hy.926 übertragbar ist. Diese
Zellen wurden gewählt, da das Endothel
eine bedeutende Rolle bei der pathophysiologischen
Bildung reaktiver Sauerstoffspezies
spielt [1, 12].
Die Quantifizierung der intrazellulären
Fluoreszenz erfolgte dabei zunächst an
Hand von Fluoreszenzfärbungen und Mikroskopiebildern
[13, 14]. Abbildung 1A
zeigt, dass nach GTN­Inkubation der
EA.hy.926­Zellen die erwartete Zunahme
der detektierten Fluoreszenz im Vergleich
zu unbehandelten Zellen beobachtet wer­
180
160
140
120
100
80
60
40
20
0
–20
–40
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0
50 µM
5 10
Zeit [Minuten]
Organische Nitrate
Abb. 1: Determination reaktiver Sauerstoffspezies mittels Fluoreszenzmikroskopie.
Dargestellt ist die relative Änderung der 123-Rhodaminfluoreszenz in EA.
hy.926 Zellen in Abhängigkeit von der Inkubationsdauer nach Stimulation mit 50
und 500 μmol/l GTN (A) sowie nach 60 min Inkubation mit 2 μmol/l Cyclosporin A
bzw. 500 μmol/l GTN allein oder zusammen (B). Dargestellt sind die Δ%-Werte
bezogen auf unstimulierte Zellen (*: signifikant gegenüber unstimulierten Zellen).
a
B
132-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
132-Rhodaminfluoreszenz
∆% zu unstimulierten Zellen
*
*
Cyclo A
*
500 µM
20 5 10 20
*
GTN
*
*
* #
*
Cyclo A + GTN
51