HerzSupplement - Pentalong von Actavis

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Herz Supplement Cardiovascular Diseases wurde die Modulation der Expression von über 1200 Genen beobachtet. Interessanterweise wurden nur etwa 70 Gene in ihre Expression sowohl von NTG als auch von PETN moduliert [16]. Diese geringe Zahl der von beiden organischen Nitraten regulierten Gene zeigt schon an, dass PETN und NTG sehr unterschiedliche Effekte auf die Genexpression vermitteln. Effekte von NTG bzw. PETN auf die Expression von Markergenen für kardiotoxische Prozesse Eine genauere Auswertung der erhaltenen Genexpressionsprofile zeigt (Abb. 8), dass die NTG- (aber nicht die PETN-)Behandlung die Expression von (Marker-)Genen verstärkt, deren Expression bei kardiovaskulären Erkrankungen erhöht ist (z.B. HuR Abb. 5: Vergleich der Sequenzen des 3’-UTR der HO-1 mRNA in verschiedenen Spezies. A: Mithilfe des Programms ECR-Browser wurde die 3’-untranslatierte Region (3’-UTR) der humanen HO-1-mRNA mit der der Maus, der Ratte, des Rhesus-Affen und des Schimpansen (Schimp) verglichen. Als Spannbreite des Suchrasters wurden 10 bp vorgegeben und als minimale Homologie 90%. Die Höhe der Kurven (50% < X < 100%) zeigt die Homologie an. B: Mithilfe des Programms RNAlogo (http://rnalogo.mbc.nctu.edu.tw/createlogo.html) wurde eine Konsensus-Sequenz für die 3’-UTR der HO-1-mRNA des Menschen, der Maus, der Ratte, des Rhesus-Affen und des Schimpansen erstellt. Dabei gibt die Größe der Buchstaben die Häufigkeit des Auftretens der spezifischen Base an. AU-reiche Bereiche sind rot umrandet. Eine putative Bindungsstelle für das RNA-BP HuR ist markiert. ANP; Literatur siehe [16]). Ebenso reduziert die NTG-, aber nicht die PETN-Behandlung die Expression von Genen, die als kardioprotektive Gene publiziert wurden. PETN induziert dagegen die Erhöhung der Expression von Genen, die als Schutzfaktoren gegen pathologische Veränderungen im Herzen beschrieben wurden, und senkt die Expression von Genen, die als negative Faktoren der Pathogenese verschiedener Herzerkrankungen beschrieben wurden. Analysiert man nun z. B. die Promotorsequenz des ANP-Gens in verschiedenen Spezies (Abb. 9), so finden sich wieder Sequenzbereiche, die zwischen den Spezies hoch konserviert sind und so wahrscheinlich an der Regulation der Aktivität des ANP- Promotors beteiligt sind. In diesen Sequenzbereichen finden sich so auch die Konsen- 60 Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel Ratte Maus Rhesus Schimp A B
a Relative Luciferaseaktivität [% von Kontrolle] 150 100 50 0 Kontrolle/EtOH Kontrolle/DMSO * ** 3UTR/EtOH 3UTR/DMSO Oligonukleotide (ODN), die zu allen möglichen Transkripten homolog sind Annotation der Gene (Panther) SAM-Analyse (Tiger-MEV) Aufbringen der ODN auf Glasträger „Heat-Map“ Behandelt Intensitätsverteilung Unbehandelt Herz 35 · 2010 · Supplement II © Urban & Vogel b Relative Luciferaseaktivität [% von EtOH bzw. DMSO] 1200 800 100 0 EtOH RNA von unbehandelten Kontrollen Alexa 546 ns 0 300 600 800 1200 1600 1800 2400 2600 2800 3000 3200 3600 3800 4000 4200 4800 5000 5400 SV40 late poly(A) signal NTG Alexa 546 Alexa 647 Normalisierung (TIGR-MIDAS) RNA von behandelten Proben Fuoreszenz- Markierung in der RT-Reaktion Pseudocoloured Alexa 647 DMSO Mischen und Hybridisierung * PETN Auslesen der Fluoreszenz-Signale (Scanarray-Express) Organische Nitrate Abb. 6: Posttranskriptionelle Regulation der humanen HO- 1-Expression. A: Humane EA. hy926-Endothel-Zellen wurden mit einem Konstrukt transfiziert, das den 3’-UTR der humanen HO-1-mRNA kloniert hinter ein Luciferase- Reportergen enthält (3’-UTR; siehe Darstellung des Konstruktes in B). Als Kontrolle erfolgte die Transfektion der Zellen mit einem Reportergen-Konstrukt ohne HO-1-3’- UTR (Control). Die Zellen wurden dann 24 h nach der Transfektion mit den Lösungsmitteln der organischen Nitrate (EtOH bzw. DMSO; wieder 24 h) behandelt (** = p < 0,01; * = p < 0,05 vs. mit Control transfizierten Zellen). Wie die Analyse der durch die Konstrukte in den Zellen induzierte Luciferase- Aktivität zeigt, hat der 3’-UTR der humanen HO-1-mRNA einen negativen Einfluss auf die Luciferase-Expression (wahrscheinlich durch Destabilisierung der mRNA). B: EA.hy926-Zellen wurden mit dem 3’-UTR-Konstrukt transfiziert und nach 24 h mit EtOH, DMSO, NTG oder PETN (wieder 24 h) behandelt. Wie die Analyse der Luciferase-Aktivität der Zellen zeigt, ändert NTG die Expression des Reportergens nicht. PETN erhöht dagegen die Luciferase-Expression um etwa das Zehnfache. Somit scheint PETN abhängig von der 3’-UTR der humanen HO-1-mRNA die Stabilisierung der Reporter-mRNA zu induzieren. Abb. 7: DNA-Microarray-Technik zur Analyse von Expressionsprofilen. Zur Bestimmung der Expression aller in einer Zelle (oder Organ/ Gewebe) exprimierten mRNAs wird die DNA-Microarray-Technik eingesetzt [17]. Bei dieser Methodik werden aus Zellen (bzw. Organen oder Geweben) Total-RNA-Proben gewonnen. Diese RNAs werden dann unter Verwendung des Enzyms Reverse Transkriptase (RT- Reaktion) in sogenannte komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Dabei werden für die RT-Reaktion mit den RNA-Proben unterschiedliche Fluoreszenz-markierte Desoxyribonukleotide (dNTPs) eingesetzt. Somit erhält man zwei unterschiedlich markierte cDNAs, die zu allen in den Zellen (Organen/Geweben) vorhandenen mRNAs komplementär sind. Diese markierten cDNAs werden dann mit einem Glasträger (der Chip) inkubiert (Hybridisierung), auf den DNA-Oligonukleotide (etwa 30 000) aufgebracht wurden, die jeweils zu einem Protein-kodierenden Gen des Organismus homolog sind. Somit erfasst dieser DNA-Chip die Expression aller Protein-kodierenden mRNAs eines Organismus. Nach der Hybridisierung werden überflüssige cDNAs abgewaschen und dann der Glasträger mithilfe eines „Microarray-Readers“ ausgelesen. Dieser „Microarray-Reader“ ist in der Lage, die Fluoreszenz der beiden eingesetzten Farbstoffe anzuregen und die Intensität der Signale für jedes aufgebrachte Oligonukleotid (der „Spot“) zu bestimmen. Da die Intensität der Fluoreszenz der eingebrachten cDNA-Menge und mithin der in der Zelle (Organ/Gewebe) exprimierten mRNA direkt proportional ist, kann somit auf einem „Chip“ das Transkriptom der unbehandelten Zellen (Organ/Gewebe) mit dem der behandelten Zellen (Organ/Gewebe) direkt verglichen werden. Durch statistische und bioinformatische Methoden können die Signale verschiedener Experimente normiert und verglichen werden. Schlussendlich erhält man Listen von Genen, deren mRNA-Expression sich durch die Behandlung ändert. Diese Listen können dann durch weitere Bioinformatik-Softwarepakete analysiert werden (Annotation der Gene, Bezug der Daten zur vorhandenen Literatur). 61
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Entwicklung einer LC-MS-Methode zur
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