Dreidimensionale konfokale Absorptionsmessungen zur räumlichen ...

2. Theorie
|hdet(x, y, z)| 2 ∼ |hbel(x, y, z)| 4
Und die detektierte Intensität Idet(x, y, z) zu
Idet(x, y, z) ∼ Ibel(x, y, z) 2
(2.25)
(2.26)
Dies ist für den Intensitätsverlauf der Detektions innerhalb der Fokalebene in Abb.
2.4 gezeigt.
Es zeigt sich, dass um den gleichen Intensitätskontrast zu erreichen und zwei Punkte
als zwei getrennte Intensitätsmaxima aufgelöst zu erkennen, man den Abstand um den
Faktor √ 2 verringern kann. So kann man nach dem so wie hier definierten Rayleigh-
Kriterium zwei neue Auflösungen angeben:
Innerhalb der Fokalebene:
∆d con 0, 61
x/y = √ ∗
2 λ
NA
für die axiale Richtung ergibt sich:
∆d con
Z = 2 √ 2 ∗
� 0, 43 ∗ λ
NA
λ ∗ n λ ∗ n
� 1.4 ∗
NA2 NA2 (2.27)
(2.28)
Weiterhin wird als Merkmal der Auflösung oftmals die sog. Halbwertsbreite (engl.
“Full Width at Half Maximum”, FWHM) des Signals angegeben. Diese Größe entspricht
der Signalbreite bei 50% der Maximalintensität ohne einen Untergrundoffset.
Zum späteren Vergleich sind diese Größen hier nochmals kurz in Tabelle 2.1 zusammengefaßt.
Raumrichtung Weitfeld-Mikroskop konfokal Rayleigh konfokal FWHM
lateral ∆dx/y � 0, 61 ∗ λ
NA
∆dx/y � 0, 43 ∗ λ
NA
axial Z-Auflösung unbestimmbar ∆dZ � 1, 4 ∗ λ∗n
NA 2
∆dx/y � 0, 37 ∗ λ
NA
∆dZ � 1, 28 ∗ λ∗n
NA2 Tabelle 2.1.: Zusammenfassung der Auflösungskriterien für beugungsbegrenzte Fokalabbildungen
Es ist dabei zu beachten, daß die hier angegebenen Beziehungen strenggenommen nur
für Optiken mit kleiner numerischer Apertur gelten. Weiterhin ist zu beachten, dass die
für diese Bestimmung angenommenen Pinhole-Durchmesser auf Null gesetzt wurden. In
der Praxis macht sich dieser Unterschied jedoch deutlich bemerkbar, da die Pinholedurchmesser
aus rein experimentell bedingten Gründen nicht zu klein gewählt werden
können. Die hier diskutierten Werte sind also die theoretische Grenze der erzielbaren
Auflösung, die mit dem hier besprochenen Aufbau erreicht werden kann.
Um nun ein Volumenabbildung der Probe aufzunehmen, wird die Probe oder der Fokus
relativ zueinander verschoben und dabei systematisch dreidimensional abgerastert. Die
detektierte Lichtintensität wird dabei für jede Position aufgezeichnet. Für jedes dieser
Voxel (Volumenpixel) ergibt sich eine Superposition aus den gewichteten Intensitäten,
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