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ANÁLISIS DE SECUENCIAS HOMÓLOGAS DE SNE1 EN PHYTOPHTHORA CAPSICI
lleva a la muerte celular programada de las células, tanto de
las infectadas como las periféricas (Tyler, 2011). Entre los
patógenos que afectan a las plantas se encuentra
Phytophthora capsici, el cual pertenece al grupo de los
oomicetos. P. capsici es un patógeno dinámico y muy
destructivo de varios vegetales, tales como, el melón, la
sandía, el chile, pimiento, pepino, la papa, habas, entre otros,
que en los últimos años ha incrementado la ocurrencia y
severidad del patógeno. Pérdidas multi billonarias son
provocadas al año tanto por P. infestans como P. capsici
(Lamour, et al 2012). Se ha intentado controlar la infección
causada por Phytophthora capsici mediante varias estrategias
que han tenido poco éxito. Esto pude deberse, a que en
estudios recientes del género Phytophthora, se ha demostrado
que éstos pueden tener cierta resistencia hacia los
tratamientos que se han intentado implementar para poder
combatirlo. El tratamiento con químicos, la rotación de
cultivos, la fumigación, entre otros, no han sido del todo
efectivos debido a la gran diversidad genética con la que
cuenta este patógeno. Se ha visto que cada aislamiento es
diferente y que muestra una resistencia diferente. Incluso, se
ha llegado a comprobar, que este patógeno crea resistencia a
los fungicidas con facilidad, lo que hace más difícil de
combatir (Hausbek y Lamour, 2004; Granke, Lamour y
Hausbek, 2012). Dentro de las moléculas que utilizan los
fitopatógenos, incluyendo bacterias, hongos y oomicetos, en
contra de las defensas de la planta, son efectores capaces de
penetrar el citoplasma de las células del huésped. Se puede
definir a un efector como las proteínas o moléculas del
patógeno que alteran la estructura celular del huésped y sus
funciones (Torto-Alalibo, et al., 2009). Una de las principales
funciones de una proteína efectora es suprimir la señal que
interviene en la respuesta de defensa de la planta. Las plantas
también producen numerosos receptores que contienen un
sitio de unión a nucleótido (NBS, por sus siglas en inglés) y
un dominio con repeticiones ricas en leucinas (LRR, por sus
siglas en inglés) que pueden detectar la presencia de
proteínas de los patógenos que han penetrado el citoplasma
(Jones y Dangl, 2006). El reconocimiento de proteínas
efectoras mediante proteínas NB-LRR activa una efectiva
respuesta de defensa que se conoce como inmunidad activada
por el efector (ETI). Debido a que esta inmunidad puede
proporcionar una defensa muy eficaz, los genes de las plantas
codifican proteínas NB-LRR que reconocen la presencia de
efectores específicos de los patógenos y se les conoce como
genes de resistencia (R). Los efectores que son reconocidos
por las proteínas NB-LRR han sido nombrados proteínas
“avirulentes” (Avr) (Tyler, 2009). La proteína efectora
presente en Phytophthora infestans, tiene relación con la
supresión de la muerte celular programada. Esta proteína
efectora fue nombrada SNE1 (supresor of necrosis 1, por sus
siglas en inglés) la cual se expresa, específicamente, durante
la fase biotrófica. Mediante la técnica de agroinfiltración se
comprobó que SNE1 se encuentra relacionado con la
supresión de la muerte celular programada en plantas de
Nicotiana benthamiana y tomate. Se ha propuesto que SNE1
se une a las proteínas avirulentas y estas ya no son
reconocidas por los genes de resistencia lo que lleva a la
supresión de la PCD (Kelley, et al., 2010). Por lo que el
objetivo del presente trabajo fue detectar la expresión del gen
Sne1 durante el inicio de la interacción entre Phytophthora
capsici y Capsicum chinense.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material biológico
Se emplearon plantas de Capsicum chinense de la variedad
criollo, con una altura de alrededor de 10 cm y 40 días de
edad. Fueron crecidas en condiciones de invernadero con un
riego cada tercer día. Phytophthora capsici fue donada, por
el laboratorio del Dr. José Juan Zúñiga del Centro de
Investigación Científica de Yucatán (CICY). La cepa fue
mantenida en Agar Papa Dextrosa (PDA) incubado a 28ºC en
oscuridad. La resiembra fue realizada cada 15 días.
Diseño de Cebadores
Se utilizaron secuencias de sne1 de Phytophthora infestans,
Phytophthora ramorum y Phytophthora sojae obtenidas del
NCBI, para encontrar las secuencias idénticas por medio de
un BLAST en el genoma de Phytopthora capsici depositado
en: http://genome.jgi.doe.gov/PhycaF7/PhycaF7.home.html.
Las secuencias que presentaron arriba del 90% de identidad
fueron empleadas para el diseño de cebadores utilizando el
programa Primer Design de IDT. Tabla 1.
Tabla 1. Cebadores diseñados para la amplificación de un fragmento del
gen SNE1.
Infección de plantas
La infección se realizó de acuerdo con el protocolo de Nuñez-
Pastrana, et al., (2011) el cual consiste, en adicionar un cubo
de agar de 0.5 cm3 con crecimiento de Phytophthora capsici.
El agar con P. capsici se colocó en una herida de 0.5 cm
ubicada en el tallo a 2 cm de la superficie de la tierra. Se
tomaron muestras a las 3, 6, 12, 24, 36, 48, 60 y 72 horas. Las
muestras fueron almacenadas a -80ºC. Este experimento se
realizó por triplicado.
Extracción de ARN
Se evaluaron cinco protocolos de extracción: el método de
Valenzuela, et al, (2005) el Plant/Fungi RNA purification kit
58 REVISTA DEL CENTRO DE GRADUADOS E INVESTIGACIÓN. INSTITUTO TECNOLÓGICO MÉRIDA Vol. 32 NÚM. 69