Impact des métaux lourds sur les interactions plante/ver de terre ...

Partie B : Matériel et Méthodesde tampon Mc Ilvain pH 5,8 et 0,3 ml de solution substrat (1%). Les tubes sont incubés sousagitation à 37°C pendant 2 heures puis centrifugés 3 min à 15000 t/m. 250 µl de surnageantsont utilisés pour déterminer les quantités de sucres réducteurs produits en utilisant les réactifsde Somogyi (1945) et Nelson (1944). La DO est mesuré à 650 nm. Les activités enzymatiquessont exprimées en µg de sucres réducteurs produits par heure et par gramme de sol.V.1.4 Dosage des hétérosidases :tel-00486649, version 1 - 26 May 2010Deux hétérosides ont été testés le PNP ß-glucoside et le PNP N-acétyl glucosamine. Ilspermettent de rendre compte de l’hydrolyse de certaines liaisons glucosidiques présentes dansla plupart des composés polysaccharidasiques.La méthode de révélation est celle décrite par Rouland et al. (1986). Pour chaqueéchantillon, 0,1 ml de sol est incubé pendant 2 heures à 37°C avec 0,4 ml de tampon McIlvain pH 5,8 et 0,1 ml de substrat (10%). La réaction est arrêtée par 3 ml de Na 2 CO 3 2%. LaDO est mesurée à 400 nm. L’activité enzymatique est basée sur le dosage des PNP libérésdans le milieu sous l’action de l’enzyme. Elle est exprimée en µg de phénol libéré par heure etpar gramme de sol sec.V.1.5 Dosage des uréases :Le dosage est effectué selon la technique de Kandeler et Gerber (1988) qui utilise l’uréecomme substrat. Après incubation, l’ammoniaque produit par l’hydrolyse de l’urée est dosépar un réactif contenant du dichloroisocyanurate. La DO est ensuite mesurée à 660 nm. Lesactivités enzymatiques sont exprimées en unité (U) qui correspond à la quantité d’azotelibérée (en µg) par gramme de sol sec et par heure.V.1.6 Dosage de la fluorescéine diacétate hydrolase (FDA)Le dosage est effectué selon la technique de Schnürer et al. (1982). Chaque échantillonde 0,1 ml de sol est incubé pendant 2 heures à 37°C avec 1,5 ml de tampon (pH = 5,8) et 25 µlde diacétate de fluorescéine à 2 mg.ml -1 dans un tube d’eppendorf. Les tubes sont ensuitecentrifugés à 4°C à 15000 tr.min -1 . 750 µl de surnageant sont transférés dans de nouveauxtubes auxquels sont ajoutés 750 µl d’acétone ; puis les tubes sont centrifugés pendant 5 min à15000 tr.min -1 . La DO est mesurée à 490 nm.40