Impact des mÃ©taux lourds sur les interactions plante/ver de terre ...

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Partie B : Matériel et Méthodesaprès la lyse cellulaire. La précipitation s’effectue à 4°C pendant 3 heures, elle est suivied’une centrifugation à 13000 g pendant 15 min. Après la récupération de la phase supérieure,le culot est à nouveau suspendu dans 900 µl de CTAB 2% (NaCl 1,4 M, EDTA 0,1 M, CTAB2%) qui permet de complexer les acides nucléiques. 900 µl de chloroforme sont ajoutés pourla déprotéinisation après incubation pendant 15 min à 68°C. Le mélange est agité doucementpuis centrifugé à 13000 g pendant 10 min à température ambiante. La phase aqueusecontenant l’ADN est récupérée. L’ADN est concentré par plusieurs phases de précipitation :dans 600 µl d’isopropanol à -20°C pendant 30 min puis dans 450 µl d’acétate d’ammonium à2,5 M et 1 ml d’éthanol 95° à -20°C pendant 1 à 3 heures. Après une dernière centrifugation,le culot est récupéré, lavé dans 1 ml d’éthanol 70° puis recentrifugé à 13000 g pendant 5 min.Le culot séché est remis en suspension dans 25 µl du tampon TE 1X.tel-00486649, version 1 - 26 May 2010VI.3 Contrôle et purification de l’ADN extraitLa pureté de l’ADN extrait est mesurée à l’aide d’un spectrophotomètre Nanodrop (ND-1000 UV-Vis Spectrophotometre, Labtech). Les protéines absorbent à 280 nm, les composéshumiques et phénoliques à 230 nm et l’ADN à 260 nm. Ensuite, une étape de purificationpermet d’éliminer les composés humiques et les autres contaminants à l’aide des kits SpinColumn S-400 HR (Amersham).Les colonnes de purification sont vortexées afin d’homogénéiser la résine puiscentrifugées à deux reprises (3000 rpm, 1 min et 4°C) libérant ainsi le tampon initialementprésent dans les colonnes. L’ADN est ensuite déposé au centre et en surface de la résine puisaprès une nouvelle centrifugation (3000 rpm, 2 min et 4°C), le contenu pur des colonnes estrécupéré dans un tube Eppendorf stérile. L’ADN ainsi purifié est quantifié au Nanodrop.VI.4 Amplification de l’ADN par Polymerase Chain Reaction (PCR)L’amplification d’ADN est effectuée avec de la Taq Polymérase Ready-To-Go(Amersham Pharmacia) dans 25 µl d’un milieu réactionnel contenant 0,25 µM de chaqueprimer et 50 ng d’ADN matrice. L’amplification est réalisée à l’aide d’un thermocycleur(Eppendorf). En fonction des couples d’amorce utilisées (bactéries et champignons) (Tableau5A et B), les conditions de températures et le nombre de cycles sont présentés dans lesTableaux 6A et B.44
Partie B : Matériel et MéthodesL’amplification est contrôlée en déposant 5 µl de produit PCR dans les puits d’un geld’agarose à 1,5 % suivi d’une migration à 100 V pendant 60 min. Le gel est ensuite coloré 15min au BET (bromure d’éthidium), rincé dans de l’eau distillée pendant 15 min égalementpuis photographié sous UV.tel-00486649, version 1 - 26 May 201045
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RéférencesJiménez, J.J., Cepeda,
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RéférencesKuperman, R.G., Carreir
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RéférencesLoué, A. (1993). Oligo
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RéférencesNNaidu, R., Bolan, N.S.
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