Impact des métaux lourds sur les interactions plante/ver de terre ...
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Partie B : Matériel et Métho<strong><strong>de</strong>s</strong>VI.5 Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE)tel-00486649, <strong>ver</strong>sion 1 - 26 May 2010Après l’amplification, 15 μl <strong>de</strong> produits PCR avec 5 μl <strong>de</strong> bleu <strong>de</strong> charge sont déposés<strong>sur</strong> un gel <strong>de</strong> polyacrylami<strong>de</strong> à 8% avec un gradient linéaire <strong>de</strong> dénaturant chimique <strong>de</strong> 30% à60% constitué par <strong>de</strong> l’urée à une concentration <strong>de</strong> 7 M et du formami<strong>de</strong> à 40%. Le gel estpréparé avec un Gradient Mixer (Roth Karlsruhe, Allemagne) connecté à une pompepéristaltique. Le gel est ensuite déposé dans une cuve <strong>de</strong> migration (D-Co<strong>de</strong> Uni<strong>ver</strong>salMutation Detection System, Bio-Rad, Californie, USA) reliée à un générateur (PROLABO,Fontenaysous-Bois, France). Après 16 heures <strong>de</strong> migration à 75 Volts dans un tampon TAE1X à une température constante <strong>de</strong> 60°C, <strong>les</strong> gels sont révélés au SYBERGREEN pendant 30minutes au froid 4°C, puis rincés 2 fois avec <strong>de</strong> l’eau milliQ et photographiés avec le systèmeUV (Fischer Bioblock Scientific, Illkirch, France) en utilisant le software BiocaptMW(Vilber-Lourmat, France). Les ban<strong><strong>de</strong>s</strong> <strong>de</strong> DGGE sont analysées grâce au logiciel GelComparII (Applied Maths, Sint-Martens, Belgique).VI.6 I<strong>de</strong>ntification et analyse <strong><strong>de</strong>s</strong> produits d’amplificationLes séquences obtenues sont comparées à cel<strong>les</strong> déjà répertoriées dans la banque <strong>de</strong>gènes du NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) à l’ai<strong>de</strong> <strong>de</strong> l’option 'BLAST search'. Lespourcentages <strong>de</strong> similarité sont ensuite déterminés entre <strong>les</strong> séquences isolées au cours <strong>de</strong>cette étu<strong>de</strong> et <strong>les</strong> séquences <strong>les</strong> plus proches répertoriées dans GenBank ou RDPII (RibosomalData Project). Les séquences sont considérées similaires lorsqu’el<strong>les</strong> ont un pourcentage <strong><strong>de</strong>s</strong>imilarité au moins égal à 97% (Wang et al., 1997).VII. Analyse statistiqueDes analyses <strong>de</strong> variance (ANOVA) ont été réalisées avec le logiciel STATGRAPHICSafin <strong>de</strong> comparer <strong>les</strong> différentes données obtenues. Le test Tukey HSD a été utilisé pour toutes<strong>les</strong> comparaisons multip<strong>les</strong> au seuil <strong>de</strong> 5%. L’analyse en composante principale (ACP) aégalement été réalisée avec le parkage ADE-4.48
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