Impact des métaux lourds sur les interactions plante/ver de terre ...

Partie B : Matériel et Méthodesculture, un dénombrement des colonies et une numération des types morphologiques observéssont effectués. La distinction morphologique des colonies est basée sur des critèresmacroscopiques de taille, forme, surface, contour, couleur de colonie, formation de spores(forme et couleur), diffusion de pigments dans le milieu, couleur de l'envers de la culture. Cesdonnées morphologiques sont présentées en annexe 2. Les souches intéressantes sont ensuiterepiquées sur milieu de Sabouraud pour obtenir des isolats.V.2.3 Profil physiologique - BIOLOGtel-00486649, version 1 - 26 May 2010Afin d’activer les communautés bactériennes, 5g de chaque échantillon sontpréalablement incubés avec 750 µl d’eau distillée dans une étuve à 25°C pendant 48h. Puis,100 ml d’eau physiologique stérile (9 g de NaCl/l d’eau distillée) sont ajoutés et l’ensembleest mis en suspension à l’aide d’un agitateur magnétique pendant 30 min à 500 rpm. Lessuspensions sont ensuite centrifugées à 800 rpm à température ambiante pendant 30 min. Lessurnageants obtenus sont transférés dans de nouveaux flacons et centrifugés encore une fois àla vitesse de 3000 rpm pendant 3 min. Les surnageants finaux sont récupérés.Des plaques BIOLOG GN2 MicroPlate TM (AES laboratoire, France) sont inoculées àraison de 150 µl de surnageant dans chacun des 96 puits à l’aide d’une pipette multicanaux etsous faible agitation. Les plaques GN2 favorisent le développement des bactéries Gramnégatives. Chaque puits contient une source de carbone différente et du chlore de tetrazoliumqui va être réduit en un composé violet absorbant à 595 nm, le formazon, lorsque la source decarbone est métabolisée. Les microplaques sont incubées à 25ºC. Les lectures à 595 nm sonteffectuées à l’aide d’un lecteur de microplaque (EL800-PC, BioTek) toutes les 24 h pendant150 h.VI/ TECHNIQUES MOLECULAIRESVI.1 Extraction ADN à partir de souches fongiques puresL’extraction de l’ADN des souches pures a été effectuée selon une méthoded’extraction directe qui consiste en une lyse physique et chimique suivie de phasesd’extraction au phénol et de précipitation à l’Isopropanol. Une seule colonie de chaquechampignon (culture de 7 jours) est prélevée à la surface du milieu de culture solide avec une42