Impact des métaux lourds sur les interactions plante/ver de terre ...

Partie B : Matériel et MéthodesV.2 CULTURE MICROBIENNE ET PROFIL PHYSIOLOGIQUEV.2.1 Numération bactérienne5 g de chaque échantillon sont placés dans un erlenmeyer stérile de 100 ml contenant 45ml d’eau physiologique stérile (9 g de NaCl/l d’eau distillée) et mis en suspension à l’aided’un agitateur magnétique pendant 30 min. La suspension est ensuite décantée pendant 20min, puis le surnageant est prélevé, il constitue la dilution 10 -1 . A partir de cette suspension,des dilutions décimales sont effectuées jusqu’à 10 -8 . Le milieu utilisé est le milieu NB (NB :extrait de bacto beef, 3 g.l -1 ; bacto pepton, 5 g.l -1 , agar, 15 g.l -1 ), un milieu non spécifiquepour bactéries auquel a été ajouté un antifongique (Nystatine).tel-00486649, version 1 - 26 May 2010Ce milieu est ensemencé avec les différentes dilutions précédemment réalisées ; pourchaque dilution, 3 répétitions sont effectuées. Les tubes à essai sont bouchés au coton cardé etincubés à 25°C dans un incubateur thermostaté (ROTATEST, BIOBLOCK). Au bout d’unesemaine, les tubes présentant une croissance sont notés « positifs » et le nombre le plusprobable de microorganismes capables d’utiliser le substrat proposé dans les conditions deculture est estimé en utilisant le tableau de McCrady (1918) en annexe 1.V.2.2 Numération fongiqueLe milieu Sabouraud (10 g.l -1 de peptone, 40 g.l -1 de glucose et 20 g.l -1 d’agar) eststérilisé dans un autoclave à 120°C pendant 20 minutes. Une fois tiédi, un antibiotique, lechloramphénicol est ajouté à la dose 500 mg.l -1 afin d’inhiber la croissance bactérienne. Lemilieu est ensuite réparti dans des boîtes de Pétri carrées de 12 cm de côté.Cinq grammes de chacun des échantillons sont remis en suspension séparément dans 50ml d’eau physiologique (9 g.l -1 NaCl). Les suspensions-mères ainsi obtenues sont agitéespendant 3 heures à température ambiante. Des dilutions successives de 10 -1 à 10 -3 sontréalisées à partir des suspensions-mères et 100 µl de chacune sont étalés dans les boîtes dePétri contenant le milieu gélosé de Sabouraud.Trois boîtes sont réalisées pour chaque dilution. Les boîtes de pétri ensemencées sontincubées, à l’obscurité, dans une étuve thermostatée à 28°C en aérobiose. Après trois jours de41