Impact des métaux lourds sur les interactions plante/ver de terre ...

Partie B : Matériel et Méthodesspatule stérile et transférée dans un tube eppendorf stérile de 2 ml. Pour éliminer l’agar, 1 g deCsCl est ajouté dans le tube eppendorf, le mélange est ensuite centrifugé à 13000 g pendant10 minutes. La plus grande partie du mycélium se trouve à la surface de la solution CsCl etpeut être prélevée. Les mycéliums sont placés au congélateur à -20°C pour le stockage.tel-00486649, version 1 - 26 May 2010Environ 250 à 300 mg de mycélium sont broyés dans les tubes Eppendorfs de 2 mlcontenant 800 µl de tampon CTAB 2% (CTAB, NaCl 5 M, EDTA 0,5 M, et Tris HCl 1 M pH8) et des billes de zirconium à l’aide d’un beadbeater (Retsch® MM 200, Germany) réglé à 30Hz. Cette étape est suivie d’une incubation à 65°C pendant 1 heure. Les tubes sont ensuitecentrifugés à 12000 g pendant 4 min, à 4°C. Un volume de Phénol Chloroforme Isoamyl(P:C:I/25:24:1) est ajouté au surnageant, puis le tout est homogénéisé lentement pendant 5min. Le mélange est à nouveau centrifugé (12000 g, 4 min, 4°C) et 600 µl de la phase aqueusesont placés dans un 'Phase Lock Gel Tube' avec un volume de Chloroforme Isoamyl(C:I/24:1), puis les tubes sont lentement homogénéisés avant d’être centrifugés à nouveau(12000 g, 4 min, 4°C). 500 µl de la phase aqueuse sont ensuite prélevés puis placés dans unEppendorf de 1,5 ml. La précipitation s’effectue avec 2 volumes d’Isopropanol à -20°Cpendant 1 heure. Une nouvelle homogénéisation est effectuée, suivie par une centrifugation à12000 g pendant 30 min à 4°C. Après récupération de la phase supérieure, le culot contenantl’ADN est lavé dans 500 µl d’éthanol 70°C froid, puis centrifugé à 12000 g pendant 4 min, à4°C. Le culot est ensuite séché à température ambiante (pendant 15 min) puis suspendu dans25 µl de tampon TE 1X.VI.2 Extraction de l’ADN génomique total du sol et des agrégatsL’ADN total des échantillons a été extrait selon la méthode de Porteous et al. (1997)légèrement modifiée pour être adaptée à nos échantillons. 1 g de sol est placé dans des tubesEppendorf de 1,5 ml. Les tubes sont placés à -20°C pendant 3 heures puis le sol est broyéavec des pilons stériles. Dans les tubes sont ensuite ajoutés 1 ml de solution de lyse stérile(NaCl 0,25 M, EDTA 0,1 M, pH 8) 80 µl de Guanidine isothiocyanate 5 M, 90 µl de SDS20% et des billes de zirconium. Les suspensions ainsi obtenues sont homogénéisées à l’aided’un beadbeater (Retsch® MM 200, Germany) réglé à 25 Hz. Les tubes sont ensuite placés à68°C pendant 1 heure puis refroidis dans un bain d’eau froide. L’ADN est récupéré dans 600µl de surnageant après centrifugation à 13000 g (12057 rpm) pendant 15 min. 75 µl d’Acétatede potassium 5 M et 250 µl de polyéthylène glycol (PEG) 40% sont ajoutés à l’ADN obtenu43