Impact des métaux lourds sur les interactions plante/ver de terre ...
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Partie B : Matériel et Métho<strong><strong>de</strong>s</strong>après la lyse cellulaire. La précipitation s’effectue à 4°C pendant 3 heures, elle est suivied’une centrifugation à 13000 g pendant 15 min. Après la récupération <strong>de</strong> la phase supérieure,le culot est à nouveau suspendu dans 900 µl <strong>de</strong> CTAB 2% (NaCl 1,4 M, EDTA 0,1 M, CTAB2%) qui permet <strong>de</strong> complexer <strong>les</strong> aci<strong><strong>de</strong>s</strong> nucléiques. 900 µl <strong>de</strong> chloroforme sont ajoutés pourla déprotéinisation après incubation pendant 15 min à 68°C. Le mélange est agité doucementpuis centrifugé à 13000 g pendant 10 min à température ambiante. La phase aqueusecontenant l’ADN est récupérée. L’ADN est concentré par plusieurs phases <strong>de</strong> précipitation :dans 600 µl d’isopropanol à -20°C pendant 30 min puis dans 450 µl d’acétate d’ammonium à2,5 M et 1 ml d’éthanol 95° à -20°C pendant 1 à 3 heures. Après une <strong>de</strong>rnière centrifugation,le culot est récupéré, lavé dans 1 ml d’éthanol 70° puis recentrifugé à 13000 g pendant 5 min.Le culot séché est remis en suspension dans 25 µl du tampon TE 1X.tel-00486649, <strong>ver</strong>sion 1 - 26 May 2010VI.3 Contrôle et purification <strong>de</strong> l’ADN extraitLa pureté <strong>de</strong> l’ADN extrait est me<strong>sur</strong>ée à l’ai<strong>de</strong> d’un spectrophotomètre Nanodrop (ND-1000 UV-Vis Spectrophotometre, Labtech). Les protéines absorbent à 280 nm, <strong>les</strong> composéshumiques et phénoliques à 230 nm et l’ADN à 260 nm. Ensuite, une étape <strong>de</strong> purificationpermet d’éliminer <strong>les</strong> composés humiques et <strong>les</strong> autres contaminants à l’ai<strong>de</strong> <strong><strong>de</strong>s</strong> kits SpinColumn S-400 HR (Amersham).Les colonnes <strong>de</strong> purification sont vortexées afin d’homogénéiser la résine puiscentrifugées à <strong>de</strong>ux reprises (3000 rpm, 1 min et 4°C) libérant ainsi le tampon initialementprésent dans <strong>les</strong> colonnes. L’ADN est ensuite déposé au centre et en <strong>sur</strong>face <strong>de</strong> la résine puisaprès une nouvelle centrifugation (3000 rpm, 2 min et 4°C), le contenu pur <strong><strong>de</strong>s</strong> colonnes estrécupéré dans un tube Eppendorf stérile. L’ADN ainsi purifié est quantifié au Nanodrop.VI.4 Amplification <strong>de</strong> l’ADN par Polymerase Chain Reaction (PCR)L’amplification d’ADN est effectuée avec <strong>de</strong> la Taq Polymérase Ready-To-Go(Amersham Pharmacia) dans 25 µl d’un milieu réactionnel contenant 0,25 µM <strong>de</strong> chaqueprimer et 50 ng d’ADN matrice. L’amplification est réalisée à l’ai<strong>de</strong> d’un thermocycleur(Eppendorf). En fonction <strong><strong>de</strong>s</strong> coup<strong>les</strong> d’amorce utilisées (bactéries et champignons) (Tableau5A et B), <strong>les</strong> conditions <strong>de</strong> températures et le nombre <strong>de</strong> cyc<strong>les</strong> sont présentés dans <strong>les</strong>Tableaux 6A et B.44